Берется анализ пцр у женщин. ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции. Подготовка к проведению диагностики

ПЦР диагностика — это методика, основанная на применении полимеразной цепной реакции, с помощью которой можно обследовать человека на инфекционные и наследственные заболевания. Анализы ПЦР на 12 инфекций показывают результат, несмотря на то, остро протекает заболевание или хронически. Некоторые специалисты считают ПЦР 12 обязательным анализом и не ставят без него окончательный диагноз. Результаты могут быть положительными даже задолго до появления симптоматики болезни.

В 20 веке Кэри Мюллис из США открыл явление полимеразной цепной реакции. В настоящее время метод ПЦР является золотым стандартом в некоторых сферах медицины. Метод является максимально эффективным для выявления болезни в активной стадии, поскольку бывают случаи, что в активной стадии обычные методы не дают такого точного результата.

Диагностика инфекционных процессов при помощи ПЦР достаточно актуальна в современном мире. Преимуществами данного вида обследований являются следующие моменты:

Обнаружение инфекционного возбудителя в анализах. Анализ предполагает выявление ДНК или РНК инфекционного агента.
Практически исключены ложные и ошибочные реакции.
Методика ПЦР 12 максимально чувствительная. Благодаря данному методу можно обнаружить даже единичные клетки инфекционных агентов.
Результат ПЦР на скрытые возбудители готов уже через 4 часа после проведения процедуры.
Способность обнаружения инфекционных агентов без отсутствия характерной симптоматики для заболевания. Метод достаточно эффективен и по происшествии конкретной болезни.

В современном мире ПЦР диагностика инфекций развивается ускоренными темпами. Методика активно совершенствуется. Появляются новые подвиды обследования ПЦР. Благодаря развитию данного метода обследования он становится максимально доступным широкому кругу людей, а стоимость при этом постепенно изменяется.

Основа полимеразной цепной реакции

Метод ПЦР проводится исключительно в лабораторных условиях. Для его осуществления используются специальные ферменты, которые увеличивают в несколько раз структуру ДНК и РНК больного. Должно образоваться такое число ДНК и РНК, чтобы можно было провести визуальный анализ. Во время обследования происходит копирование того участка РНК или ДНК, который идеально подходит под требуемые условия.

В лаборатории существует соответствующая база данных, в которой указано точное строение различных инфекционных агентов. Благодаря методу ПЦР можно не просто увидеть возбудителя, но и подсчитать его количественное соотношение.

ПЦР-диагностика предполагает и определенные новшества, среди которых можно выделить следующие:

введение мутаций;
соединение отдельных фрагментов ДНК;
определение отцовства и др.

Инфекции, выявляемые ПЦР-анализом

ПЦР диагностика может выявить следующие инфекционные процессы:

гепатиты следующих разновидностей: А, В, С, G;
вирус Эпштейн-Барра, возбудитель инфекционного мононуклеоза;
цитомегаловирус;
микобактерии туберкулеза;
герпес 1 и 2 типа;
многие инфекции, передающиеся половым путем: уреаплазмоз, гарднереллез, хламидиоз, микоплазмоз, трихомониаз.
ВПЧ и его онкогенные подвиды;
клещевой энцефалит и боррелиоз;
кандидозная инфекция;
листериоз;
инфекция хеликобактер пилори.

И это лишь часть наиболее распространенных инфекций, которые можно выявить при помощи ПЦР. ПЦР анализ крови активно применяется в гинекологической сфере медицинской практики, а также в таких областях, как:

пульмонологическая;
фтизиатрическая;
гастроэнтерологическая;
онкологическая;
многие другие разделы медицины.

Правила сбора материала на анализ

Чужеродные ДНК и РНК можно выявить, обследовав разнообразные биологические жидкости конкретного человека. Для того чтобы обследовать человека на присутствие определенных инфекций, передаваемых половым путем, необходимо взять на пробу выделения из половых органов (мазок или соскоб) больного и его мочу.

Если возникла необходимость обследовать человека на различного рода инфекции (ВИЧ, герпес, гепатит и другие), то берется ПЦР анализ, для чего используется кровь больного.

Чтобы диагностировать герпетическое поражение, мононуклеоз, нужно взять мазок из полости рта больного. Для подтверждения ЦМВИ для осуществления анализа берется моча больного. Возникают случаи, когда обследуют спинномозговую жидкость для выяснения причин возникших неврологических отклонений.

Врач-пульмонолог при этом обследует методом ПЦР мокроту и жидкость из плевры конкретного больного.

Если у новорожденного ребенка возникло подозрение на внутриутробное инфицирование, врачи берут анализ околоплодных вод у беременной женщины и кусочек тканей плаценты.

Сдача анализа: особенности процедуры и расшифровка результатов

Все пациенты, обследуемые по методу ПЦР, получают наиболее достоверный результат. В данном случае возникновение ошибок практически исключено. Результаты данного анализа готовятся достаточно быстро, что облегчает постановку диагноза и обеспечивает своевременное назначение лечебных мероприятий.

Достоверность результата ПЦР напрямую зависит от правильности сдачи материала на обследование. Материал не должен быть загрязнен, иначе результат исследования не будет объективен. К наиболее важным рекомендациям перед сдачей анализа ПЦР относятся следующие требования:

Запрещено проявлять половую активность за сутки до проведения анализа.
Анализ крови на инфекции необходимо сдавать на голодный желудок в утреннее время.
Моча сдается утром в стерильный контейнер.

Результат анализа будет готов через 1,5-2 суток после проведения рассматриваемой процедуры. Встречаются такие ситуации, когда результат может быть подготовлен в тот же день.

Расшифровка результатов

Результат данного вида обследования может быть положительным и отрицательным. Отрицательный результат анализа крови говорит о том, что инфекционных элементов в сданном материале нет. Большое количество проведенных анализов ПЦР показывает отрицательный анализ.

Положительный анализ ПЦР подтверждает тот факт, что в сданном материале обнаружены инфекционные агенты и необходимо качественное, максимально эффективное лечение больного.

Результат может быть положительным, но какие-либо проявления заболевания отсутствуют. Это говорит или о начале заболевания, или о его носительстве. Если выявлено носительство болезни, то никакие лечебные мероприятия не требуются. Просто необходимо наблюдаться у специалиста. Примерами таких заболеваний являются:

папилломавирусная инфекция;
герпес и др.

Обычно их обнаруживают в слюне, соскобе из цервикального канала, уретре. Однако необходимо помнить, что больной человек может заразить абсолютно здоровых, несмотря на то, что его данная болезнь никак не беспокоит. Заболевание может перейти в хроническую форму. Следует отметить, что в тех случаях, когда ПЦР анализ крови показал положительный результат, назначение лечебных мероприятий просто необходимо.

Анализ ПЦР имеет еще и количественную характеристику. Количественный результат оценивает только специалист, он индивидуален для разных инфекций. Основываясь на количественной характеристике, врач способен понять, насколько активен данный патологический процесс, поставить точную стадию развития конкретного заболевания. Благодаря анализированию полученных результатов специалист может выбрать необходимый препарат и, возможно, пересмотреть дозировку препарата.

Точность ПЦР диагностики

Специалистам дают ПЦР 3 важнейших характеристики, среди которых выделяют:

Точность.
Специфичность.
Чувствительность.

Диагностика инфекций методом ПЦР имеет большую вероятность обнаружения инфекционных агентов. ПЦР анализ крови и других жидкостей высокоспецифичен. С его помощью можно легко выявить конкретный инфекционный процесс. Диагностика ПЦР обладает высокой чувствительностью. Если в исследуемом материале содержится минимальное количество инфекционных агентов, метод ПЦР будет всегда положителен.

Наиболее редко бывает ложноположительный результат. Если инфекции нет, то и результат отрицателен.

ПЦР на скрытый инфекционный процесс

Если у человека подозревают ИППП, то назначают анализ крови на скрытые инфекции. Половые заболевания можно выявить лишь путем обследования больного. Скрыто могут протекать такие заболевания, как:

хламидиоз;
уреаплазмоз;
гонорея;
герпес;
гарднереллез;
микоплазма.

Вышеперечисленные половые инфекции достаточно распространены и при этом коварны. На начальной стадии развития заболевания они не дают яркой симптоматики, и больные не обращаются за помощью. ПЦР анализ крови, соскобы со слизистой мочеиспускательного и цервикального канала обязательны при подозрении на эти инфекции.

ИППП очень негативно влияют на репродуктивную систему. Они способны вызвать бесплодие или пороки у плода. В связи с этим перед тем, как планировать беременность, нужно сдать анализ ПЦР.

Популярностью пользуется ПЦР на 12 инфекций. Диагностика методом ПЦР 12 проводится благодаря сдаче мазков из половых органов. Забор материала производится через 2 часа после акта мочеиспускания. За 2 дня до исследования нельзя вводить во влагалище суппозитории и проводить спринцевания. Результат анализа будет готов уже через 2 дня.

Стоимость ПЦР колеблется в зависимости от исследуемой инфекции. Цена находится в диапазоне от 200 до 500 рублей за каждую инфекцию. Войти и обследоваться в частной лаборатории можно и самостоятельно, без направления врача.

Полимеразная цепная реакция известна уже 30 лет. Ее широко используют во многих областях, начиная с археологии и заканчивая генетикой.

Именно метод пцр помогает установить отцовство, но наиболее часто его используют для выявления различных инфекционных болезней в организме человека.

Как проводят анализ методом пцр, и что это такое? На эти вопросы мы постараемся детально ответить.

Анализ ПЦР - что это такое?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии, так и задолго до того, как заболевание может себя проявить.

Метод ПЦР - абсолютно специфичен и выполненный правильно не может дать ложноположительный результат. То есть, если инфекции нет, то анализ никогда не покажет, что она есть. Поэтому сейчас очень часто для утверждения диагноза дополнительно сдают анализ ПЦР, чтобы определить возбудителя и его природу.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в 1983 году разработал Кэри Мюллис (США), за что в 1993 году он удостоен Нобелевской премии в области химии.

В чем преимущество данного метода?

Диагностика этим методом позволяет найти возбудителя непосредственно в гене, который содержится в исследуемых материалах. Это самый точный анализ на половые инфекции, скрытые инфекции, различные венерические заболевания.

Отличия ПЦР-диагностики от других методов лабораторного исследования заключаются в следующем:

метод нацелен на выявление самого возбудителя;
диагностика методом ПЦР отличается универсальностью: для обнаружения возбудителей нескольких;
заболеваний достаточно только одного биологического образца больного;
метод обладает высокой чувствительностью и не сопровождается другими перекрестными реакциями.

Кроме этого, преимуществом ПЦР-диагностики является то, что для анализа пригоден любой биологический материал пациента: кровь, выделения из половых органов, моча, сперма.

Какие инфекции позволяет выявить мазок на ПЦР?

В организме может присутствовать большое количество возбудителей инфекций, сюда относятся и «скрытые», которые длительное время никак себя не проявляют.

Анализ мазка на ПЦР позволяет выявить такие инфекции :

уреплазмоз половых органов;
кандидоз ();
герпес;
наличие раковых клеток;
оценить гормональное состояние;

Исследуемым материалом для ПЦР обычно являются мокрота, слюна, моча, кровь. Перед проведением анализа необходимо тщательно подготовиться к нему, получив предварительную консультацию у врача.

Кровь для ПЦР обычно сдается натощак. Хорошие результаты показывает проведение анализа, когда материал для исследования взят из цервикального канала или уретры. В этом случае лучше всего провести ПЦР-диагностику не позже, чем через сутки после полового акта.

Разновидности ПЦР

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах. Существуют разные методики проведения анализа:

ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) - используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК.
Инвертированная ПЦР (Inverse PCR (англ.)) - используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.
Вложенная ПЦР (Nested PCR (англ.)) - применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции.
Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) - проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа.
Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR (англ.)) или ПЦР в реальном времени - используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции.
Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.)) - с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров.
Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) - ПЦР для родственных последовательностях внутри одного или между разными видами, используя консервативные праймеры к этим последовательностям.

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: …ATH…, где Н - А, Т или С.

Какие биологические материалы исследуются?

Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК бактерии или ДНК или РНК вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека:

Моча . Может использоваться при инфекционном поражении мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин (у мужчин использование в качестве материала мочи заменяет эпителиальный соскоб).
Мокрота . Применяется для диагностики туберкулеза и реже для диагностики респираторных форм хламидиоза и микоплазмоза. Мокроту в количестве 15-20 мл собирают в стерильный (одноразовый) флакон.
Биологические жидкости . Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна забираются по показаниям.
Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек . Обычно используются для диагностики заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП), таких как гонорея, хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез, герпетическая и другие инфекции, поражающие слизистые оболочки.
Биоптаты . Чаще всего используют биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления хеликобактерной инфекции.
Кровь, плазма, сыворотка . Используются для ПЦР анализа вирусов гепатитов B, C, D, G, герпеса, ЦМВ, ВИЧ, исследования генов человека.

Как подготовиться к сдаче анализа?

Моча сдается утром в стерильный контейнер.
Анализ крови на инфекции необходимо сдавать на голодный желудок в утреннее время.
Не стоит проявлять половую активность за сутки до проведения анализа.

Расшифровка анализа ПРЦ

Процесс интерпретации представленного исследования отличается своей простотой. Результаты пцр анализа можно получить через 1,5-2х суток после сдачи материала. В некоторых случаях результат готов в первый же день, и вот что они могут означать:

Отрицательный результат показывает, что в диагностируемом материале отсутствует искомый инфекционный возбудитель.
Пцр положительный обозначает, что в организме человека присутствует ДНК или РНК возбудителя.

В некоторых случаях производят количественное определение микроорганизмов. Это особенно актуально при заболеваниях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Так как данные бактерии проявляют свое негативное воздействие лишь при избыточном количестве.

Также количественный анализ ПЦР важен для выбора терапевтической тактики и с целью контроля над лечением таких вирусных инфекций, как ВИЧ и вирусы гепатита.

Насколько точна ПЦР диагностика инфекций?

Метод ПЦР отличается высокой точностью, специфичностью и чувствительностью. Это означает, что данный анализ способен:

точно определить наличие или отсутствие инфекции;
точно указать, что именно это за инфекция (специфичность);
обнаружить инфекцию даже при очень низком содержании ДНК микробов в биологическом материале,
который был подвергнут исследованию (чувствительность).

ПЦР анализ: цена и сроки

Цена конкретного анализа будет зависеть от того, на какую инфекцию вы будете проверяться. Примерные цены и сроки:

ИППП: 300-500 руб, сроки – 1 день;
Вирус Эпштейна-Барра, вирус папилломы человека, герпеса, цитомегаловирус: 300-500 руб, сроки – 1 день;
Гепатит A, B, C, D, G: качественный анализ 650 руб, количественный анализ 2000 руб. Сроки – до 5 дней;
Антитела к вирусу гепатита С, суммарные (Anti-HCV) – 420 руб;
Антитела к вирусу гепатита C, IgM (Anti-HCV IgM) – 420 руб;
Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori): 300-400 руб, сроки – 1 день;
ВИЧ (антитела и антигены) – 380 руб;
РНК ВИЧ, качественно – 3 500 руб;
РНК ВИЧ, количественно – 11 000 руб.

Чтобы сэкономить средства, можно выбирать фиксированный пакет анализов. Такую услугу предоставляет большинство клиник где можно сдать анализ методом ПРЦ (инвитро, онклиник и т.д).

Для успешного лечения самым важным моментом является быстрая и безошибочная диагностика. В последнее время перечень методик и возможностей диагностических центров, поликлиник и больниц в сфере диагностирования постоянно расширяется. После появления относительно новой методики - ПЦР-анализа, этот метод быстро завоевал приверженцев среди медицинских работников, поскольку часто является незаменимым при выявлении инфекционных заболеваний.

Сфера применения метода, основанного на полимеразной цепной реакции, не ограничивается медициной, но самое большое распространение ПЦР-диагностика получила для выявления различных болезней.

К неоспоримым достоинствам ПЦР можно отнести следующие:

Очень высокая чувствительность. Обычно говорят о чувствительности от 95 до 100%, но это усредненные данные. Этот показатель отличается для разных микроорганизмов. Так, для гепатита С он не бывает ниже 97% (при условии выполнения всех требований), а для определения уреаплазмоза - не менее 99%. Такая чувствительность является самой высокой на данный момент, поэтому способ почти не имеет конкурентов по этой характеристике.
Возможность применения на самых ранних стадиях. В то время, когда другие методы диагностики еще не способны выявить возбудителя из-за его малого количества в образце пробы, ПЦР уже выдает корректный результат. Обнаружить присутствие возбудителя можно даже при наличии единственного экземпляра, а в некоторых случаях - только фрагмента микроба. По этой причине способ применяется и при хронических или скрытых течениях патологий, а также в стадии инкубации.
Широкий спектр результатов. Анализ способен выявить одновременно несколько возбудителей, для этого не понадобится проводить повторные манипуляции. Иногда удается найти возбудителей, которые даже не предполагались при первичной диагностике.
Универсальность образцов. В качестве пробы могут быть представлены образцы крови, слюны, мокроты, волосы, выделения из влагалища, клетки разных тканей.
Скорость получения результатов. В большинстве случаев ответ получают через 5-6 часов. Для культурального анализа, приближающегося к полимеразной цепной реакции в плане точности, такой же результат можно получить в срок от нескольких дней до пары недель.
Количественное определение возбудителя. Этот параметр позволяет определять титр микробов в материале, а это свойство часто необходимо для оценки эффективности выбранной тактики лечения.
Выявление самого микроорганизма, а не определение его реакций. Большинство анализов основаны на ответной реакции возбудителя на химические реактивы, окрашивание и т. д. Этот способ диагностики позволяет обнаруживать непосредственно микроб, а не косвенные признаки, антитела и т. п.

Несмотря на такой широкий перечень преимуществ, у метода есть и некоторые недостатки:

Из-за загрязнения пробы предыдущим образцом может произойти ложное выявление микроорганизмов. Такое происходит при загрязнении инструментов или реактивов, участвующих в ходе анализа. Даже в воздухе присутствуют фрагменты микробов, способных отразится на результате, поэтому в таких лабораториях обязательно должен быть установлен биологический фильтр с максимальной степенью очистки воздуха.
Ложноотрицательный результат. Даже при всех явных проявлениях болезни иногда получают отрицательные данные. Причина этого – в неверно выбранном месте для взятия образца, поэтому персонал лаборатории должен обладать достаточной квалификацией, знаниями и опытом.
Оценка данных должна производиться исключительно лечащим врачом, потому что интерпретация результатов ПЦР-анализа - сложный процесс. Наличие положительного ответа не всегда означает болезнь. Дело в том, что после того, как заболевание успешно пролечено, фрагменты возбудителя долго присутствуют в крови, поэтому заключение может сделать только очень квалифицированный специалист.
Высокая стоимость диагностики с применением полимеразной цепной реакции. Цена обусловлена дорогостоящим оборудованием и высокими требованиями к условиям лабораторий и квалификации персонала.

Обязательные условия для получения точных данных в ПЦР-лабораториях:

корректный механизм забора проб и их правильная транспортировка в лабораторию;
точное соблюдение методик в ходе выполнения анализа;
высокая стерильность и максимальная автоматизация процесса;
использование одноразовых инструментов;
система внутрилабораторного контроля для подтверждения достоверности данных.

При условии выдерживания всех требований на основе данных, полученных при помощи методики ПЦР, можно не только определить болезнь, но сделать прогноз ее течения и составить алгоритм лечения.

Суть метода

Полимеразная цепная реакция позволяет быстро скопировать и воспроизвести ДНК-цепочки микроба, который вызвал заболевание. Для того, чтобы процесс шел быстро, используют специальные ферментные препараты, ускоряющие репликацию и постройку цепочки нуклеотидов.

После того, как процедура происходит в полном объеме, присутствие в пробе возбудителя увеличивается в миллионы раз, после чего его выявление и идентификация не составляют проблемы.

Лаборант может сравнить полученный образец с представленными в базе данных и безошибочно назвать его, а также определить его исходное количество.

Кроме того, методика позволяет клонировать отдельные участки цепи ДНК, вызывать в них необходимые мутации, объединять и комбинировать участки между собой.

Сферы применения

Самое большое распространения ПЦР-диагностика получила в медицине. С помощью нее можно определить вирусные, инфекционные, наследственные болезни, причем сделать это можно не только в активной фазе, но и сразу после заражения.

Области медицины, в которых метод ПЦР активно используется для диагностики:

урология и гинекология - для обнаружения большинства венерических заболеваний (уреаплазмоз, герпес, сифилис, гонорея, гарднереллез, трихомониаз, хламидиоз, ВИЧ, микоплазмоз, папилломавирус человека, кандидоз и пр.);
пульмонология - при туберкулезе или пневмониях бактериальной или вирусной природы;
гастроэнтерология - при хеликобактериозе;
в гематологии - при цитомегаловирусе, различных онковирусах крови;
в области инфекционных болезней - для выявления дифтерии, сальмонеллеза, мононуклеоза, листериоза, гепатитов вирусного происхождения, энцефалита;
в онкологии - для определения рака груди, лейкемии, лимфомы.

Этот метод применяют и в неонатологии, педиатрии, офтальмологии, неврологии - практически в любой отрасли медицины он оказался необходим.

На видео подробно рассказано, какие инфекции можно выявить с помощью полимеразной цепной реакции.

Большинство заболеваний, передающихся половым путем, быстро и успешно диагностируются именно благодаря ПЦР-диагностике. Кроме определения возбудителя, этот метод позволяет узнать конкретный штамм микроорганизма, что делает возможным выбор наиболее действенного препарата при лечении.

Помимо медицины способ ПЦР используется и в других сферах:

Криминалистика и судебная медицина - помогает установить личность преступника посредством сравнения генетического материала подозреваемого человека с образцами, найденными на месте совершения преступления.
Установление отцовства - сравниваются размноженные генетические наборы родителя и ребенка, находятся идентичные фрагменты, на основании чего можно судить о степени их родства.
Наука использует методику в ходе экспериментов, применяя генные мутации, устанавливая родство эволюционных веток отдельных организмов и т.д.

ПЦР-диагностика в венерологии

Многие инфекции, вызывающие венерические болезни, на начальных стадиях очень сходны по проявлениям и симптоматике, поэтому дифференцировать их достаточно сложно. В то же время раннее определение инфекционного агента позволяет начать лечение как можно раньше и сократить время лечения до минимума, избежав развития возможных осложнений.

Полимеразная цепная реакция - эффективный механизм для определения таких групп заболеваний половой сферы:

бактериальные инфекции (сифилис, донованоз, гонорея, хламидиоз и пр.);
вирусные патологии (папилломатоз, кондиломатоз, ВИЧ, половой герпес и т.д.);
грибки (молочница, баланопостит и пр.)

В дерматовенерологии особенно полезно свойство данной методики находить инфекционных агентов в периоды ремиссий или при носительстве, когда человек может заражать партнеров, не имея при этом симптомов болезни.

Ход анализа полимеразной цепной реакции

Анализ ПЦР происходит в 4 основных этапа:

подготовка материала к копированию;
объединение фрагмента ДНК и праймера;
копирование генетического набора исследуемого материала;
идентификация и оценка полученного ДНК-набора.

Этап 1

Образец подогревают до температуры 94-98°C в специальном приборе - амплификаторе, который программируется на выдерживание точных температур с низкой погрешностью. Заданная температура держится на протяжении минуты-двух. Это необходимо для денатурации ДНК, чтобы двойная спираль разошлась на две отдельные цепочки.

Этап 2

Температура в амплификаторе понижается до 72-75°C для того, чтобы праймер смог распознать сходный с ним участок ДНК-цепи и объединиться с ним.

Праймеры - это специальные реагенты, которые подходят только к одному виду возбудителя. Если необходимо провести анализ на несколько патогенов, то в образец добавляют необходимое количество праймеров.

На этой стадии ДНК реплицирует свою матрицу, используя праймер.

Возможности лаборатории ограничены наличием праймеров для определенных микроорганизмов, поэтому диапазон возможностей определяется наличием таких образцов.

Этап 3

В этом отрезке происходит увеличение генетического материала возбудителя. К праймеру с матрицей приближается фермент и воспроизводит новую цепь ДНК, идентичную той, которая содержалась в первоначальной цепочке.

Когда синтез окончен, завершается один полный цикл полимеразной цепной реакции. По времени он продолжается в среднем до 3 минут. За это время происходит удваивание материала. Дальнейшее увеличение количества цепочек происходит в геометрической прогрессии, и к окончанию анализа успевает пройти 50-80 циклов.

Этап 4

Этап, требующий внимательности и особой тщательности со стороны персонала.

Определение микроорганизма происходит с использованием электрофореза или меток, наносимых окраской. При использовании электрофореза определяющим моментом становится длина фрагментов ДНК, а при использовании меток - развитие окраски в ходе ферментативной реакции.

Разновидности ПЦР-анализов

Вариаций такой ПЦР диагностики существует много. Выбор определенного метода зависит от многих факторов: предположительного диагноза, возможностей доступных лабораторий, метода взятия материала и пр.

Наиболее часто используются такие разновидности ПЦР:

вложенная;
ступенчатая;
с горячим стартом;
виртуальная;
ассиметричная;
в реальном времени и т. д.

Преимущественно используют ПЦР в реальном времени, так как способ характеризуется самыми точными результатами и максимальной скоростью обработки данных. После его применения заключение готово через час-два.

Метод широко используется в педиатрии для выявления вирусов и инфекций крови, генетических заболеваний, TORCH-инфекций. Неонатологи назначают такую диагностику в проблемных случаях буквально с первых дней жизни. Иногда подобная диагностика позволяет обнаружить инфицирование внутриутробных вод, составляющих опасность для развития плода в период активного формирования.

Если врач выдает направление на обследование с применением полимеразной цепной реакции, то он должен уточнить, какой именно биоматериал необходимо предоставить пациенту и каким образом подготовиться к отбору пробы.

Анализ крови

Кровь в качестве биоматериала для тестирования берут при подозрении на ВИЧ, вирусный гепатит, токсоплазмы, половой герпес и цитомегалию. Для большинства этих патогенов до использования этого метода диагностика базировалась на выявлении антител к возбудителю, что сильно затягивало время обнаружения микробов в тот период, когда антитела еще не вырабатываются.

Перед сдачей крови для диагностики в данном случае не нужны особые приготовления, но лучше, если проба будет отобрана натощак. Единственное обстоятельство, способное серьезно исказить результаты - прием антибиотиков, поэтому сдаче должен предшествовать временной отрезок после приема подобных лекарств в несколько дней или недель в зависимости от типа антибиотика.

В самых современных клиниках в последнее время для отбора крови на ПЦР используют вакуумные системы, которые минимально повреждают кожные покровы и сводят к минимуму вероятность попадания в пробу загрязняющих агентов из воздуха, инструментов или рук лаборантов.

Анализ мазка

Используется как в гинекологии, так и в венерологии для определения заболеваний, передающихся половым путем. Часто назначают ПЦР мазка во время беременности для выявления скрытых факторов, способных негативно повлиять на формирование плода или ход беременности.

Подготовка к отбору материала заключается в том, чтобы полностью исключить половые контакты за несколько суток до процедуры. Проводить спринцевания марганцовкой или настоями трав тоже нельзя. На протяжении критических дней и 2-х дней после них мазок на ПЦР-анализ не берется.

Отбор биоматериала производят в лаборатории из влагалища, шейки матки, цервикального канала или уретры.

ПЦР-анализ мазка позволяет выявить патоген, который устойчив к определенному виду антибиотиков. Кроме того, показаниями к такому виду диагностического обследования выступают:

осложненная беременность без видимых причин;
острое течение венерической болезни;
предположительное хроническое течение венерического заболевания;
выявление причин бесплодия или самопроизвольных абортов.

Анализ кала

Анализ кала с применением полимеразной цепной реакции назначается специалистом для уточнения наличия инфекции. Подготовка к отбору пробы кала для ПЦР заключается в следующем:

исключить за несколько суток слабительные средства в виде любых свечей, масел или оральных медикаментов;
не употреблять накануне лекарства или продукты, которые придают калу выраженную окраску.

Материал для ПЦР-определения лучше всего доставить в специальном контейнере для кала с палочкой. Внутреннее пространство контейнера стерильно, поэтому протирать или промывать его не следует. Во время отбора образца важно отслеживать, чтобы не задеть внутреннюю поверхность приемника, также в пробе не должно быть следов мочи. Перед отбором запрещено применение клизм.

Анализ мочи

Такое исследование с помощью ПЦР позволяет извлечь ДНК образец вируса или бактерии. Забор мочи лучше проводить утром натощак. Лучше всего, если это будет происходить непосредственно в лаборатории.

Обязательные условия подготовки для получения результатов исследования мочи в лаборатории полимеразной цепной реакции:

выдержать 3 недели после приема антибиотиков;
перед отбором жидкости не пить и не есть;
запрет вагинального секса за сутки до сдачи пробы;
в контейнер нужно поместить первую порцию материала после пробуждения.

Интерпретация результатов

Расшифровку результатов диагностики проводит специалист, направивший пациента на ПЦР-исследование. В протоколе, выданном лабораторией, может фигурировать отрицательный или положительный результат ПЦР:

Отрицательный - случай, в котором не обнаружено фрагментов возбудителя предполагаемой болезни, то есть человек здоров и не перенес этого заболевания в недавнем времени.
Положительный - в пробе обнаружены РНК или ДНК патогена и человек нуждается в лечении.

Самостоятельно трактовать полученные данные не стоит, так как возрастные нормы могут значительно отличаться, а различные титры - свидетельствовать о совершенно разных стадиях болезни и подходах к терапии.

Вооружившись результатами ПЦР-диагностики, врачу будет легко определить перечень необходимых мер лечения.

Точность ПЦР-диагностики сделала эту методику незаменимой в диагностировании огромного перечня заболеваний и позволила эффективнее выявлять и ликвидировать патогенные процессы, происходящие в организме человека.

В конце статьи см.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.
Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

Проведение ПЦР

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
термостабильная ДНК-полимераза;
дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе - приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.
Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией - разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии - 0,5 - 2 минут.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это - стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.
Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию

Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках - долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.

РНК– рибонуклеиновая кислота - биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев - нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.

Нуклеоти́ды - основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) - гуанин, цитозиновый (C) - цитозин, тиминовый (Т) - тимин, урациловый (U) - урацил. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов - A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа - A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК - рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.

Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

Литература

Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. - М.: Мир, 2002. - 589 с., илл. ISBN 5-03-003328-9
Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия - Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. - 496 с.; илл. ISBN 5-94087-098-8
Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы - М.: Наука, 2005 - В 2 т. - ISBN 5-02-033278-X

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

В современной медицине проведение ПЦР анализа биологических жидкостей организма является высокоточным и информативным. При помощи данного анализа выявляют наличие в организме вирусных и микробных частиц, даже если болезни протекают скрыто и не дают никаких симптомов.

Что значит назначение вам ПЦР анализа? Эта аббревиатура расшифровывается как метод полимеразной цепной реакции - это особый способ проведения лабораторных исследований. При данном методе полученный от пациента биологический материал размещается в специальном аппарате. К исследуемой среде прибавляют набор ферментов-реактивов, которые помогают воспроизводить генетический материал возбудителя (вируса или микроба). При реакции воспроизводится большое количество копий ДНК или РНК, что позволяет идентифицировать путем сравнения с базой данных как вирусную, так и микробную инфекцию.

Что означает результат ПЦР анализа? Если в организме человека имеется возбудитель каких-либо инфекций, даже скрытый, при данном анализе будет выявлено не только его наличие, но и в каком количестве данная инфекция присутствует в теле.

Для анализа на инфекции методом ПЦР можно исследовать все биологические жидкости организма - кровь, моча, слюна, выделения половых органов, слизь горла и носа. Для анализа требуется совсем немного материала, так как если возбудители имеются, за счет воспроизведения их копий, концентрация генетической информации доводится до такой, которая выявит микроб или вирус, и определит его вид. Точность анализа ПЦР очень высока, при помощи данного анализа можно на сегодня определить практически все широко распространенные вирусные, микробные и иные инфекции.

Но, что же чаще всего выявляет анализ ПЦР? К списку инфекций, которые можно выявить данным методом можно отнести инфекционные, в том числе и социально опасные инфекции по типу туберкулеза или гепатитов В и С. Этим же методом можно выявить ВИЧ-инфекцию, хламидийную и уреаплазменную инфекции, микоплазмоз как респираторной системы, так и генитальный. При помощи данного анализа выявляют молочницу, бактериальный вагиноз, трихомониаз. Возможности данного метода позволяют выявлять скрытые инфекции - герпес разных типов, ВПЧ (папилломавирус), а также выявление особого микроба, ответственного за развития язв желудка - хеликобатера.

Сегодня сдать анализ методом ПЦР можно практически в любой частной или государственной лаборатории. Данные виды анализов проводят всем, детям и взрослым. В зависимости от того, какую цель преследует анализ, в зависимости от пола проводятся анализ разного биологического материала.

Так, анализ ПЦР у мужчин проводит по крови или моче, секрету уретры, слизи из глотки или носа, соку простаты или даже сперме. Проведение анализа ПЦР у женщин возможно в крови и моче, влагалищном секрете, выделениях из уретры, слизи носа и глотки.

Очень часто применяют анализ ПЦР при беременности, с его помощью во влагалищном секрете или крови выявляют скрытые инфекции, требующие особого наблюдения в этот период, а иногда и адекватного лечения.

ПЦР как берут анализ

Анализ на инфекции данным методом назначает врач, зачастую сбор материала проводится сразу в кабинете доктора - уролога или гинеколога. Как делается анализ ПЦР?

Исследуемый материал в лаборатории смешивают с реактивами и ждут реакции. При наличии возбудителей, копии их ДНК или РНК размножаются. Выявленные фрагменты генетического материала аппарат сравнивает с базами данных и точно выявляет возбудителя инфекции. Пи необходимости, также указывается и количество возбудителя в тех или иных жидкостях тела. Обычно исследование длится не более 1-2 суток, при необходимости - проводят экспресс-анализы.

Откуда берут анализ ПЦР? Это будет зависеть от того, какие виды возбудителя предполагаются. Если это ВИЧ или гепатиты - берется кровь, если это половые инфекции - берется мазок с уретры или влагалища. При подозрении на мононуклеоз или герпес берут мазок с горла. Также могут использоваться моча, спинномозговая жидкость, отделяемое из ран, мокрота и тд.

Анализ крови ПЦР

Для точных результатов и диагностики инфекций важно сдавать кровь в утренние часы натощак. Анализ крови методом ПЦР способен выявить возбудителей опасных заболеваний - ВИЧ, гепатиты, сифилис. В периоды обострения и активности вируса в крови могут быть выявлены вирусы герпеса, папилломы и некоторые другие.

ПЦР анализ: подготовка

Для абсолютной точности анализа важна правильная к нему подготовка. Проще всего подготовиться к анализу крови, никаких ограничений в диете или активности нет, кровь нужно сдать утром, натощак. Анализ мочи сдают после подмывания гениталий, из средней порции в специальный стерильный контейнер. Анализ ПЦР из половых путей заслуживает особого внимания, поэтому важно знать, как подготовиться. За сутки до обследования запрещается секс, перед исследованием рекомендовано не мочиться. При менструации у женщин, дата анализа переносится на 3-5 дней с момента последних выделений.

Сколько времени делается анализ ПЦР

Анализ в зависимости от возможности лаборатории может готовиться от нескольких часов до нескольких дней. В среднем, сколько дней делается анализ ПЦР? Обычно это одни -двое суток. При экстренной ситуации анализ может быть выполнен в этот же день, через несколько часов.