Caracteristicile generale ale replicării ADN-ului. Etape de replicare. Polimerizarea și repararea enzimelor ADN-ului

1. Iniţiere.

Replicarea începe în regiuni strict definite ale ADN - puncte de origine ale replicării - ori (de la originea engleză - începutul). Iată secvențele de nucleotide specifice - cutii de ADN, recunoscute de proteina inițiator, cu care se leagă ulterior alte enzime de replicare. Deoarece sinteza ADN-ului are loc numai pe o matrice monocatenară, trebuie să fie precedată de separarea obligatorie a două catene ADN, adică pregătirea unei matrice, care include următoarele procese:

· Helicazele ADN desfășoară dubla helix a ADN folosind energia ATP. Locul începutului divergenței lanțurilor este numit furcă replicativă datorită formei Y caracteristice.

· Topoizomerazele ADN ameliorează stresul topologic (supraîncărcare) în timpul desfăcerii ADN-ului. Pentru a face acest lucru, enzima rupe mai întâi firul ADN, apoi se atașează covalent la capătul rupt. Această legătură are o energie semnificativă, astfel încât reacția este reversibilă și nu necesită costuri suplimentare de energie. Au fost găsite două tipuri de topoizomeraze: topoizomeraza I (introduce pauze monocatenare) și topoizomeraza II (introduce pauze dublu catenare în ADN).

· Proteinele SSB (din proteinele de legare ADN monocatenare englezești) se leagă de regiunile monocatenare și stabilizează duplexul neînvârtit, prevenind formarea acului de păr.

Șablonul ADN este gata. Acum este necesar să se construiască un lanț complementar din trifosfații dezoxiribonucleozidici (dNTP) disponibili în celulă către fiecare dintre lanțurile moleculei ADN părinte. Enzimele care catalizează reacția de adiție dezoxiribonucleotidică determinată de ADN-ul șablon se numesc ADN polimeraze (DNAP).

Prima ADN polimerază a fost descoperită în 1957 de A. Kornberg, iar în 1959 a primit Premiul Nobel pentru descoperirea mecanismului biosintezei ADN-ului.

ADN-urile cele mai bine studiate în procariote sunt:

· DNAP I. Funcții:

5'-3 '- exonuclează (poate elimina nucleotida 5'-terminală)

· DNAP II. Rolul nu este pe deplin înțeles. Nu participă la replicare.

· DNAP III. Principala enzimă de replicare. Funcții:

Polimerază (conectează nucleotidele cu legăturile fosfodiesterice),

3'-5'-exonuclează (poate elimina nucleotida 3'-terminală)

DNAP are două caracteristici:

În primul rând, ADN polimerazele nu pot începe sinteza ADN-ului, ci pot adăuga doar noi unități de dezoxiribonucleotid la capătul 3 'al unui lanț polinucleotidic existent. În consecință, ADN-ul trebuie pregătit. Grundul (grundul) necesar pentru funcționarea DNAP constă din ARN (aproximativ 15-17 nucleotide) și este sintetizat de enzima primază. Primaza se leagă de helicază și ADN pentru a forma o structură numită primozom. Apoi DNAP III se atașează la grund și prelungește firul.

În al doilea rând, sinteza noii catene de polimerază se realizează numai în direcția 5'-3 'de-a lungul catenei șablon orientate antiparalel, adică 3'-5 '. Sinteza lanțurilor în direcția opusă nu are loc niciodată, prin urmare, lanțurile sintetizate în furca replicativă trebuie să crească în direcții opuse. Sinteza unui lanț (conducător, conducător) are loc continuu, iar celălalt (întârziat) - în fragmente. Lanțul principal crește de la capătul 5 'la capătul 3' în direcția furcii de replicare și are nevoie de un singur act de inițiere. Creșterea lanțului întârziat merge, de asemenea, de la capătul 5 'la capătul 3', dar în direcția opusă mișcării furcii replicative. Pentru sinteza unui lanț întârziat, trebuie să apară mai multe evenimente de inițiere, în urma cărora se formează multe lanțuri scurte (fragmente Okazaki), a căror lungime în procariote este de 1000-2000 nucleotide.

La începutul fiecărui fragment Okazaki, există un primer ARN, care trebuie îndepărtat. ribonucleotidele nu ar trebui să fie prezente în ADN. DNAP I, datorită activității sale de exonuclează 5'-3', îndepărtează grundul și îl înlocuiește cu deoxiribonucleotide. Decalajul dintre două fragmente Okazaki adiacente este cusut cu enzima ADN ligază folosind energia ATP.

2. Alungirea (alungirea lanțului).

Un complex de enzime de replicare, numit replicizom, se deplasează de-a lungul moleculei ADN șablon, desfășurând-o și construind fire de ADN complementare.

3. Reziliere (sfârșitul replicării).

ADN-ul conține site-uri de terminare a replicării care conțin secvențe specifice de care se leagă proteinele terminatoare, împiedicând propagarea în continuare a furcii de replicare. Sinteza ADN se încheie.

Am remarcat mai devreme că, pe lângă activitatea polimerazei, DNAP are și exonuclează 3'-5 '. Este necesar pentru corectare, adică îndepărtarea unui nucleotid introdus incorect. DNAP verifică dublu corespondența fiecărei nucleotide cu șablonul: o dată înainte de a o încorpora în catena de creștere, a doua oară înainte de a încorpora următoarea nucleotidă.

Rata de replicare în procariote este de 500 nucleotide / sec.

Metode de replicare

· De tip Θ. Ocelul replicativ se extinde în direcții opuse de-a lungul moleculei circulare de ADN. Aceasta creează o structură intermediară care seamănă cu litera greacă θ. Este caracteristic procariotelor și unor viruși.

· De tip Σ (mecanism cu inel de rulare). Replicarea începe cu ruperea unei legături fosfodiesterice într-unul din lanțurile moleculei circulare părinte. DNAP se atașează la capătul 3 'liber și construiește un nou fir. Structura intermediară are forma literei σ. Acest tip de replicare se găsește în unele virusuri, în special în bacteriofagul lambda.

· Replicarea moleculelor liniare cu formarea mai multor furci replicative care se deplasează unul către celălalt. Este caracteristic tuturor eucariotelor și virușilor cu molecule liniare de ADN.

Caracteristici ale replicării în eucariote

1. Replicarea are loc în perioada S a ciclului mitotic al celulei.

2. Există multe repliconi într-o moleculă de ADN; există mai multe puncte de replicare.

3. DNP polimeraze:

· Α - ADN polimerază. Principala enzimă de replicare. De asemenea, posedă activitatea primazelor. Sintetizează fragmente de Okazaki.

· Β - ADN polimerază - enzimă reparatoare (elimină deteriorarea ADN-ului).

Γ - ADN polimeraza asigură sinteza ADN-ului mitocondrial

· Δ - ADN polimeraza este implicată în sinteza lanțului principal.

4. Lungimea fragmentelor Okazaki este de 100-200 nucleotide.

5. Viteza de replicare 50 nucleotide / sec.

6. Există o enzimă telomerază care prelungește capătul 3 'al ADN-ului înainte de replicare, deoarece de fiecare dată după replicare, lungimea capătului 3 'al moleculei de ADN liniar este redusă cu dimensiunea primerului. Tulburările de alungire ale telomerilor sunt asociate cu carcinogeneza și îmbătrânirea.

Astfel, din materialul discutat mai sus, putem concluziona că semnificația biologică a replicării este reproducerea corectă a informațiilor genetice, care sunt necesare pentru ca materialul ereditar al celulelor fiice să fie identic cu materialul ereditar al celulei mame. Acest lucru este foarte important atât pentru dezvoltarea și funcționarea normală a organismelor multicelulare, cât și pentru implementarea reproducerii vegetative.

Acizii nucleici joacă un rol important în asigurarea activității vitale a celulelor organismelor vii. Un reprezentant important al acestui grup de compuși organici este ADN-ul, care transportă toate informațiile genetice și este responsabil pentru manifestarea trăsăturilor necesare.

Ce este replicarea?

În procesul de divizare, celulele trebuie să crească cantitatea de acizi nucleici din nucleu, astfel încât să nu existe pierderi de informații genetice în proces. În biologie, replicarea este duplicarea ADN-ului prin sintetizarea unor noi catene.

Scopul principal al acestui proces este de a transfera informații genetice către celulele fiice neschimbate fără nicio mutație.

Enzime și proteine ​​de replicare

Duplicarea unei molecule de ADN poate fi comparată cu orice proces metabolic dintr-o celulă care necesită proteinele corespunzătoare. Deoarece în biologie, replicarea este o componentă importantă a diviziunii celulare, prin urmare, aici sunt implicate multe peptide auxiliare.

• ADN polimeraza este cea mai importantă enzimă de reduplicare, care este responsabilă pentru sinteza lanțului fiică. În citoplasma celulei, în timpul procesului de replicare, prezența trifosfaților nucleici, care aduc toate bazele nucleice, este obligatorie.

Aceste baze sunt monomeri acid nucleic, prin urmare, întregul lanț al moleculei este construit din ele. ADN polimeraza este responsabilă pentru procesul de asamblare în ordinea corectă, altfel sunt inevitabile toate tipurile de mutații.

• Primaza este o proteină responsabilă de formarea unui primer pe șablonul ADN șablon. Acest primer este, de asemenea, numit primer, pentru enzima ADN polimerază, este important să existe monomeri inițiali din care este posibilă sinteza suplimentară a întregului lanț polinucleotidic. Această funcție este îndeplinită de primer și de enzima corespunzătoare.
• Helicaza (helicaza) formează o furcă de replicare, care este o divergență a lanțurilor matrice prin ruperea legăturilor de hidrogen. Acest lucru face ca polimerazele să se apropie mai ușor de moleculă și să înceapă sinteza.
• Topoisomerază. Dacă ne imaginăm o moleculă de ADN sub forma unei frânghii răsucite, pe măsură ce polimeraza se mișcă de-a lungul lanțului, se va forma o tensiune pozitivă datorită răsucirii puternice. Această problemă este rezolvată de topoizomerază - o enzimă care rupe lanțul pentru o perioadă scurtă de timp și desfășoară întreaga moleculă. După aceea, zona deteriorată este cusută din nou, iar ADN-ul nu este stresat.
• Proteinele SSB, ca și grupurile, se atașează la firele de ADN din furca de replicare pentru a preveni re-formarea legăturilor de hidrogen înainte de sfârșitul procesului de reduplicare.
• Ligaza. constă în coaserea fragmentelor Okazaki pe firul rămas al moleculei de ADN. Acest lucru se întâmplă prin tăierea primerilor și inserarea monomerilor nativi ai acidului dezoxiribonucleic în locul lor.

În biologie, replicarea este un proces complex cu mai multe etape, care este extrem de important în diviziunea celulară. Prin urmare, utilizarea diferitelor proteine ​​și enzime este esențială pentru o sinteză eficientă și corectă.

Mecanism de replicare

Există 3 teorii care explică procesul de duplicare a ADN-ului:

1. Conservatorul susține că o moleculă de acid nucleic fiică are o natură matricială, iar a doua este complet sintetizată de la zero.
2. Semi-conservator propus de Watson și Crick și confirmat în 1957 în experimente pe E. Coli. Această teorie spune că ambele molecule de ADN fiice au o catenă veche și una nou sintetizată.
3. Mecanismul de dispersie se bazează pe teoria conform căreia moleculele fiice au regiuni alternante pe toată lungimea lor, constând atât din monomeri vechi, cât și din noi.

Modelul semi-conservator a fost acum dovedit științific. La ce este replicarea nivel molecular? La început, helicaza rupe legăturile de hidrogen ale moleculei de ADN, deschizând astfel ambele lanțuri pentru enzima polimerazei. Acestea din urmă, după formarea semințelor, încep sinteza de noi lanțuri în direcția 5'-3 '.

Proprietatea antiparalelă a ADN-ului este principalul motiv pentru formarea lanțurilor conducătoare și întârziate. Pe catena principală, ADN polimeraza se mișcă continuu, iar pe catena întârziată formează fragmente Okazaki, care în viitor vor fi conectate folosind ligază.

Caracteristici de replicare

Câte molecule de ADN există în nucleu după replicare? Procesul în sine implică o dublare a setului genetic al unei celule, prin urmare, în perioada sintetică a mitozei, setul diploid are de două ori mai multe molecule de ADN. Această intrare este de obicei etichetată 2n 4c.

Pe lângă semnificația biologică a replicării, oamenii de știință au găsit aplicarea procesului în diferite domenii ale medicinei și științei. Dacă în biologie, replicarea este o dublare a ADN-ului, atunci în condițiile de laborator multiplicarea moleculelor de acid nucleic este utilizată pentru a crea câteva mii de copii.

Această metodă se numește polimerază reacție în lanț(PCR). Mecanismul acestui proces este similar cu replicarea in vivo; prin urmare, enzime și sisteme tampon similare sunt utilizate pentru cursul său.

concluzii

Replicarea este de o importanță biologică vitală pentru organismele vii. Transmiterea în timpul diviziunii celulare nu este completă fără dublarea moleculelor de ADN, prin urmare, activitatea coordonată a enzimelor este importantă în toate etapele.

Este o moleculă a eredității, apoi, pentru a realiza această calitate, trebuie să se copieze cu precizie și astfel să păstreze toate informațiile disponibile în molecula ADN originală sub forma unei secvențe specifice de nucleotide. Acest lucru se realizează printr-un proces special care precede divizarea oricărei celule din corp, care se numește replicarea ADN-ului.

Esența replicării ADN este că o enzimă specială rupe legăturile slabe de hidrogen care leagă nucleotidele celor două lanțuri. Ca rezultat, catenele de ADN sunt deconectate, iar bazele azotate libere „ies” din fiecare catenă (aspectul așa-numitei furci de replicare). O enzimă specială ADN polimerază începe să se deplaseze de-a lungul catenei de ADN liber de la capătul 5 la capătul 3 (catena principală), ajutând la atașarea nucleotidelor libere, sintetizate constant în celulă, la capătul de 3 "al ADN-ului nou sintetizat catenă. Pe cea de-a doua catenă ADN (catenă întârziată) se formează ADN nou sub formă de segmente mici, formate din 1000-2000 nucleotide (fragmente Okazaki).

Pentru a începe replicarea fragmentelor de ADN ale acestei catene, sinteza fragmentelor scurte de ARN (trăsăturile caracteristice ale ARN vor fi discutate mai jos), deoarece sunt necesare semințe, pentru care se folosește o enzimă specială - ARN polimeraza (primaza). Ulterior, primerii de ARN sunt îndepărtați, ADN-ul este introdus în golurile formate folosind ADN polimeraza I. Astfel, fiecare catena de ADN este utilizată ca șablon sau șablon pentru construirea unei catene complementare, iar replicarea ADN este semi-conservată (adică o catena în o nouă moleculă de ADN este „veche”, iar a doua este nouă).

Celula folosește enzime diferite pentru a reproduce lanțurile de conducere și în urmă. Ca urmare a replicării, se formează două noi molecule de ADN absolut identice, care sunt, de asemenea, identice cu molecula de ADN originală înainte de începerea reduplicării sale (procesul de replicare a ADN-ului este prezentat mai detaliat în Fig. 3.5). ADN polimeraza, ca orice altă enzimă, accelerează semnificativ procesul de atașare a nucleotidelor complementare la lanțul ADN liber, cu toate acestea, afinitatea chimică a adeninei pentru timină și a citozinei pentru guanină este atât de mare încât se combină între ele chiar și în absența ADN polimeraza într-un amestec simplu de reacție.

Se poate spune, oarecum simplificator, că fenomenul dublării exacte a unei molecule de ADN, care se bazează pe complementaritatea bazelor acestei molecule, constituie baza moleculară a eredității. Rata de replicare a ADN-ului la oameni este relativ lentă și ar dura câteva săptămâni pentru a reproduce ADN-ul oricărui cromozom uman dacă replicarea a început dintr-un singur punct. De fapt, în molecula de ADN a oricărui cromozom, fiecare cromozom uman conține o singură moleculă de ADN, există multe situri de inițiere a replicării (repliconi). De la fiecare replicon, replicarea se desfășoară în ambele direcții până când replicoanele vecine se îmbină. Prin urmare, replicarea ADN-ului în fiecare cromozom se desfășoară relativ repede.

Replicarea (din replicatio latină - reînnoire) este procesul de sinteză a unei molecule ADN fiice pe matricea moleculei ADN părinte. În timpul diviziunii ulterioare a celulei mamă, fiecare celulă fiică primește o copie a moleculei de ADN, care este identică cu ADN-ul celulei mamă originale. Acest proces asigură transmiterea exactă a informațiilor genetice din generație în generație. Replicarea ADN-ului este efectuată de un complex enzimatic complex format din 15-20 de proteine ​​diferite, numit replicizom.

Replicarea ADN este un eveniment cheie în cursul diviziunii celulare. Este esențial ca în momentul divizării ADN-ul să fie complet reprodus și o singură dată. Acest lucru este asigurat de anumite mecanisme de reglare a replicării ADN-ului.

Replicarea are loc în trei etape:

1. Inițierea replicării

2. Alungirea

3. Încetarea replicării.

Reglementarea replicării se realizează în principal în etapa de inițiere. Acest lucru este destul de ușor de implementat, deoarece replicarea poate începe nu din orice bucată de ADN, ci dintr-una strict definită, numită site-ul inițierii replicării. În genom, pot exista doar unul sau mai multe astfel de site-uri. Strâns legat de noțiunea de site de inițiere a replicării este noțiunea de replicon. Un replicon este o întindere de ADN care conține un sit de inițiere a replicării și se reproduce odată ce sinteza ADN începe de la acel sit. Genomii bacterieni, de regulă, reprezintă un replicon, ceea ce înseamnă că replicarea întregului genom este rezultatul unui singur act de inițiere a replicării.

Genomul eucariotelor (precum și cromozomii lor individuali) constă dintr-un număr mare de repliconi independenți, ceea ce reduce semnificativ timpul total de replicare al unui cromozom individual. Mecanismele moleculare care controlează numărul de acte de inițiere a replicării la fiecare sit în timpul unui ciclu de diviziune celulară se numesc controlul numărului de copie. În plus față de ADN-ul cromozomial, celulele bacteriene conțin adesea plasmide, care sunt repliconi individuali. Plasmidele au propriile mecanisme de control al copiei: pot furniza sinteza unui singur exemplar al plasmidei pe ciclu celular sau a mii de copii.

Replicarea începe la locul inițierii replicării cu desfacerea dublei spirale ADN, cu formarea unei furci de replicare - locul replicării directe a ADN-ului. Fiecare site poate forma una sau două furci de replicare, în funcție de faptul că replicarea este unidirecțională sau bidirecțională. Replicarea bidirecțională este mai frecventă. La ceva timp după începerea replicării, un ochi de replicare poate fi observat într-un microscop electronic - o secțiune a unui cromozom în care ADN-ul a fost deja replicat, înconjurat de secțiuni mai extinse de ADN non-replicat.

În furca de replicare, ADN copiază un complex proteic mare (replicizom), a cărui enzimă cheie este ADN polimeraza. Furca de replicare se mișcă cu o rată de aproximativ 100.000 de perechi de baze pe minut în procariote și 500-5000 în eucariote.

Mecanismul de replicare moleculară:

Enzimele (helicaza, topoizomeraza) și proteinele care leagă ADN-ul desfac ADN-ul, mențin matricea într-o stare diluată și rotesc molecula de ADN. Corectitudinea replicării este asigurată de potrivirea exactă a perechilor de baze complementare și de activitatea ADN polimerazei, care este capabilă să recunoască și să corecteze eroarea. Replicarea în eucariote este efectuată de mai multe ADN polimeraze diferite (spre deosebire de replicarea ADN în procariote).

ADN polimeraza I acționează asupra catenei rămase pentru a îndepărta primerii de ARN și pentru a reproduce situsurile de ADN purificat. ADN-polimeraza III este principala enzimă de replicare a ADN-ului care sintetizează catena de ADN principală și fragmentele Okazaki în timpul sintezei unei catene întârziate (fragmentele Okazaki sunt fragmente de ADN relativ scurte care se formează pe o catena întârziată în timpul replicării ADN-ului). Apoi, moleculele sintetizate sunt răsucite conform principiului supraînfășurării și al compactării ulterioare a ADN-ului. Sinteza consumă energie.

Lanțurile moleculei de ADN diverg, formează o furcă de replicare și fiecare dintre ele devine o matrice pe care se sintetizează o nouă catenă complementară. Ca rezultat, se formează două noi molecule de ADN dublu catenar, identice cu molecula părinte.

Replicare- transferul de informații de la ADN la ADN, auto-dublarea ADN-ului (biosinteza ADN-ului).

O moleculă de ADN formată din două spirale dubleîn timpul diviziunii celulare. Dublarea ADN-ului pe baza faptului că la desfăcerea firelor, fiecare fir poate fi completat copie complementară, astfel, obținerea a două catene ale moleculei de ADN, copierea originalului.

Condiții necesare pentru replicare: 1.) Matrice- Catenele ADN. Împărțirea firului se numește furcă replicativă... Se poate forma în interiorul unei molecule de ADN. Se mișcă în direcții diferite, formându-se ochi replicativ... Există mai mulți astfel de ochi în molecula de ADN eucariot, fiecare cu două furci. 2.) Substrat... Materialul plastic este trifosfați deoxinucleotidici: dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Apoi se descompun monofosfați deoxinucleotidici, două molecule de fosfat anorganic cu eliberare de energie, adică sunt amândoi sursa și energie, și material plastic... 3.) Ioni magneziu. 4.) Complex enzimatic replicativ... A) ADN - proteine ​​de derulare: - ADN-A(provoacă divergența firului); - helicase(scindă catena ADN); - topoizomeraza 1și 2 (desfăcut peste spirală). Rupere (3 ", 5") - legături fosfodiester... Topoisomeraza 2 din procariote se numește girază... b) Proteine ​​care împiedică conectarea firelor de ADN ( Proteine ​​SSB). v) ADN polimeraza(catalizează formarea legăturilor fosfodiesterice). ADN polimeraza doar prelungește o catena deja existentă, dar nu poate uni două nucleotide libere. G) Primaza(catalizează formarea unei „sămânțe” pentru sinteză). Aceasta este în structura sa ARN polimeraza, care conectează nucleotide unice. e) ADN ligază. 5.) Grunduri- „sămânță” pentru replicare. Acesta este un fragment scurt format din trifosfați ribonucleotidici(2-10). Formarea grundului este catalizată primazoy.

Etape de replicare: 1.) Iniţiere(formarea unei furci replicative); 2.) Elongaţie(sinteza unor fire noi); 3.) Excluderea primerilor; 4.) Rezilierea(finalizarea sintezei a două lanțuri fiice).

Inițierea replicii:- reglează moleculele proteice de semnalizare - factorii de creștere; - furnizați enzimeși proteine ​​speciale.

Enzime esențiale: ADN topoizomeraza- enzime care desfac supercoilele ADN. ADN helicaza- rupe legăturile de hidrogen într-o moleculă de ADN bicatenar. Ca urmare, furcă replicativă (ochi replicativ).

Proteinele care se leagă de catene de ADN monocatenare se leagă de ADN monocatenar și previn conexiunea lor complementară.

Alungirea replicii. Substraturile de sinteză sunt trifosfați deoxinucleozidici, jucând rolul materialului de construcție și al surselor de energie.

Enzime esențiale: ADN primază, care catalizează sinteza moleculelor scurte de primeri de ARN pentru ADN polimerază. ADN polimeraza asigură includerea nucleotidelor complementare celei „vechi”, adică lanțul șablon, în lanțul „nou” în creștere.

Sinteza noilor catene de ADN poate continua doar în direcție de la capătul 5 ’spre capătul 3’... ADN-ul este sintetizat continuu pe un fir Lanț de conducere, iar pe de altă parte, se formează fragmente scurte - lanțul „întârziat” (fragmente de Okazaki).

După îndepărtarea grundurilor ADN ligază cusături fragmente scurte de Okazaki împreună ( reziliere).

Informațiile sunt transmise mod matricial. Semi-conservator Mecanismul de replicare a ADN-ului.

Principala semnificație funcțională a procesului de replicare a ADN este de a furniza descendenților informații genetice. Pentru a asigura stabilitatea genetică a unui organism și a unei specii, ADN-ul trebuie să fie reprodus complet și cu o precizie foarte mare. Procesul de replicare a ADN-ului este complex. Implică multe enzime. Primul studiu enzimologic al replicării ADN-ului a fost realizat de Arthur Kornberg, care a descoperit o enzimă în Escherichia coli, numită acum ADN polimerază I. Această enzimă prezintă mai multe tipuri de activitate enzimatică și se caracterizează printr-o structură complexă. Ca substraturi, ADN polimeraza I folosește trifosfați deoxiribonucleozidici, derivați ai adeninei, guaninei, citozinei și timinei. Activitatea polimerazei, demonstrată pentru prima dată pentru ADN polimeraza I, este inerentă altor polimeraze ale celulelor procariote și eucariote, în timp ce este important să ne amintim că funcția principală a ADN polimerazei 1 a E. coli sa dovedit a fi repararea ADN-ului.

Inițierea sintezei ADN-ului

Pentru a iniția sinteza ADN (Fig. 38.13), sunt necesare secvențe scurte de ARN (10-200 nucleotide), care acționează ca primeri. Sinteza începe cu o reacție între gruparea 3-hidroxil a primerului ARN și gruparea a-fosfat a trifosfatului deoxiribonucleozid, în timpul căreia reziduul deoxiribonucleozid este atașat la primerul ARN cu clivarea simultană a pirofosfatului. Gruparea 3-hidroxil a monofosfatului dezoxiribonucleozidic atașat efectuează în continuare un atac nucleofil asupra grupării a-fosfat a următoarei trifosfat dezoxiribonucleozidic încorporat, de asemenea, cu eliminarea pirofosfatului. Bineînțeles, alegerea următoarei nucleotide la fiecare etapă a sintezei este determinată de șablonul ADN-ului, conform regulilor propuse mai întâi de Watson și Crick (Fig. 38.14). Deci, dacă reziduul monofosfat de adenină desoxiribonucleozidă se află în poziția corespunzătoare a lanțului șablon, atunci timidina trifosfat va intra în reacție și gruparea sa a-fosfat va fi atacată de gruparea 3-hidroxil a ultimului reziduu al lanțului de creștere. Reacția are loc numai dacă nucleotida inserată formează o pereche complementară cu următorul nucleotid al lanțului ADN șablon și, datorită legăturilor de hidrogen, ocupă o poziție în care grupul 3-hidroxil al lanțului în creștere atacă noul nucleotid și îl încorporează în polimerul. Secvențele de ADN atașate primerilor de ARN au fost numite după omul de știință japonez care le-a descoperit - fragmente Okazaki (Fig. 38.15). La mamifere, după formarea unui număr semnificativ de fragmente Okazaki, începe complexul de replicare

(vezi scanare)

Orez. 38.13. Inițierea sintezei ADN-ului prin ARN-primer și adăugarea ulterioară a celui de-al doilea dezoxiribonucleozid trifosfat.

Orez. 38.14. Funcția matricială a catenei ADN în sinteza inițiată de primer ARN a catenei complementare.

Orez. 38,15. Polimerizarea intermitentă a dezoxiribonucleotidelor și formarea fragmentelor Okazaki.

pentru a îndepărta semințele de ARN și a umple golurile rezultate cu deoxiribonucleotide corespunzătoare. Apoi, folosind ADN ligază, fragmentele sunt „cusute” împreună pentru a forma un lanț ADN continuu.

Polaritatea de replicare

După cum sa menționat deja, moleculele de ADN constau din două catene antiparalele. Replicarea ADN în pro și eucariote are loc simultan pe ambele fire. Cu toate acestea, enzima care conduce sinteza ADN-ului în direcție nu există și, prin urmare, se pare că lanțurile nou sintetizate nu pot crește în aceeași direcție în același timp. În ciuda acestei contradicții, una și aceeași enzimă efectuează o sinteză aproape sincronă a ambelor lanțuri. În acest caz, lanțul sintetizat în direcția 5-Y („conducător”) se dovedește a fi continuu. Sinteza celui de-al doilea lanț („întârziat”) se realizează în fragmente de 150-200 nucleotide. Următoarele acte de inițiere a sintezei acestor fragmente, care au loc în fiecare acest moment de asemenea, în direcție se efectuează, deoarece furca de replicare se mișcă în general într-o direcție. Schema sintezei ADN-ului „semicontinuu” este prezentată în Fig. 38,16.

Replicarea ADN-ului nuclear de mamifere

Orez. 38,16. Procesul de replicare semicontinuă, simultană a ambelor catene de ADN bicatenar.

majoritatea primerilor de ARN sunt eliminați la sfârșitul procesului; între timp, în timpul replicării genomului mitocondrial, fragmente mici de ARN rămân integrate într-o moleculă de ADN circular închis.

Polimerizarea și repararea enzimelor ADN-ului

În nucleele celulelor de mamifere există o clasă de polimeraze, așa-numitele alfa polimeraze (Pol a), care sunt responsabile de replicarea cromozomială. O moleculă Pol a este capabilă să încorporeze aproximativ 100 de nucleotide pe secundă în lanțul în creștere, astfel funcționează de aproximativ zece ori mai lent decât ADN-polimeraza bacteriană. Scăderea vitezei poate fi atribuită interferenței de la nucleozomi. Nu se cunoaște modul în care ADN polimeraza traversează nucleozomii. Cu toate acestea, se știe că după finalizarea replicării, nucleozomii corespunzători sunt distribuiți aleatoriu în ambele catene fiice.

În nucleele celulelor de mamifere s-a găsit și o ADN polimerază cu o greutate moleculară mai mică decât cea a Pol a - polimeraza beta (Pol, care nu este implicată în procesul obișnuit de replicare, dar este necesară pentru repararea ADN-ului (vezi mai jos) O altă mitocondrială, ADN-polimerază gamma (Poli) replică genomul mitocondrial circular.

Replicarea completă a genomului mamiferelor este finalizată în 9 ore - timpul necesar duplicării materialului genetic al unei celule divizatoare diploide. Această viteză indică faptul că replicarea începe simultan în multe locuri, numite punctele de origine ale replicării și denotate ori (de la originea engleză - începutul). Există aproximativ 100 de astfel de puncte (site-uri). Replicarea are loc în două direcții, iar ambele lanțuri sunt reproduse simultan. În acest caz, așa-numitele „bule de replicare” se formează pe cromozom (Fig. 38.17).

Site-urile care joacă rolul de puncte de origine ale replicării în eucariote nu sunt bine definite. Sunt disponibile date mai complete în acest sens pentru drojdie și mai mulți viruși de origine animală. Putem spune cu încredere că procesele de inițiere sunt controlate atât în ​​aspectul spațial, cât și în aspectul temporal, deoarece clusterele vecine sunt inițiate sincron. Se crede că domeniile funcționale ale cromatinei sunt reproduse ca unități integrale. Aceasta presupune că punctele de origine ale replicării sunt situate într-un mod destul de clar în raport cu unitățile de transcriere.

Orez. 38.17. Formarea „bulelor de replicare” în procesul de sinteză a ADN-ului. Sunt prezentate replicarea bidirecțională și locația presupusă a proteinelor de derulare în furculițele de replicare.

Orez. 38,18. O schemă ipotetică pentru acțiunea unei proteine ​​ADN-monocatenare specifice într-o furcă de replicare. Pe măsură ce a doua catenă este sintetizată, proteina este eliberată și atașată la regiunile nou formate de ADN monocatenar. (Amabilitatea lui V. Alberts.)

(vezi scanare)

Orez. 38,19. Compararea a două tipuri de reacții care repară rupturile de ADN monocatenar. Reacțiile din stânga sunt catalizate de ADN ligază, iar cele din dreapta sunt catalizate de ADN topoizomeraza. (Ușor modificat și reprodus, cu permisiunea lui Lehninger A. L.: Biochimie, ediția a II-a. Worth, 1975.)

În timpul replicării, ADN-ul cu catenă dublă trebuie să se împartă în catenele individuale, astfel încât fiecare dintre ele să poată funcționa ca un șablon. Separarea catenelor de ADN este facilitată de molecule de proteine ​​specifice care stabilizează structura monocatenară în timpul propagării furcii de replicare. Proteinele stabilizatoare se leagă stoichiometric de o singură catenă fără a interfera cu nucleotidele care acționează ca șablon (Fig. 38.18). Împreună cu separarea firelor, ar trebui să se producă și desfacerea helixului (1 rotație pentru fiecare 10 nucleotide), însoțită de răsucirea firelor fiice nou sintetizate. Având în vedere timpul necesar procesării procariotelor pentru a se replica, se poate calcula că molecula ADN ar trebui să se relaxeze la o viteză de 400.000 rps, ceea ce este complet imposibil. Prin urmare, trebuie să existe mai multe „balamale” situate pe întreaga lungime a moleculei de ADN. Funcțiile balamalei sunt îndeplinite de o enzimă specială (ADN topoizomeraza), care face pauze într-unul din lanțurile dublei spirale de derulare. Pauzele sunt rapid suturate de aceeași enzimă fără costuri suplimentare de energie, deoarece energia necesară este stocată sub forma unei legături covalente de mare energie care apare între coloana vertebrală zahăr-fosfat a lanțului ADN și topoizomeraza. Afișat în Fig. 38.19, schema acestui proces poate fi comparată cu secvența de evenimente de legare încrucișată a ADN-ului catalizate de ADN ligaza. Topoizomerazele ADN sunt, de asemenea, responsabile pentru desfacerea ADN-ului supraînfășurat. ADN-ul supraînfășurat este o structură foarte ordonată formată din molecule de ADN circulare sau ultra-lungi când este răsucită în jurul nucleului histonei (Fig. 38.20).

Una dintre clasele de virusuri animale (retrovirusuri) are enzime capabile să sintetizeze o moleculă de ADN dintr-un șablon de ARN. ADN polimeraza dependentă de ARN sau transcriptaza inversă (acesta este numele acestei enzime) sintetizează mai întâi un hibrid ARN-ADN utilizând genomul ribonucleic al virusului ca șablon. Apoi, enzima RNase H îndepărtează catena ARN, iar catena ADN rămasă, la rândul ei, servește ca șablon pentru sinteza celei de-a doua catene ADN. Astfel, apare o copie ADN bicatenar de ADNc, care conține informații prezentate în principal sub forma genomului ARN al retrovirusului.

Reglarea sintezei ADN-ului

La celulele animale și umane, replicarea ADN are loc numai într-o anumită perioadă a vieții celulei. Această perioadă se numește sintetică (așa-numita -fază). Faza β este separată de mitoză prin perioadele presintetice și postsintetice (Fig. 38.21).

Orez. 38,20. Super răsucire a ADN-ului. Super-spirala toroidală (solenoidă) stânga (stânga) se transformă într-o super-bobină dreaptă atunci când miezul cilindric este îndepărtat. O tranziție similară are loc în timpul distrugerii nucleozomilor în cazul extragerii histonelor cu soluții saline concentrate.

Reglarea primară a sintezei ADN-ului celulei este că replicarea are loc la un moment strict definit și în principal în celulele care se pregătesc pentru divizare. Nucleotidele purinice ciclice și, eventual, substraturile sintezei ADN sunt implicate în reglarea intrării celulelor în faza β. Mecanismul acestei reglementări rămâne necunoscut. Multe oncovirusuri sunt capabile să slăbească sau să distrugă conexiunile interne de informații care controlează intrarea celulelor în faza β. În acest caz, mecanismul rămâne neclar, deși este posibil ca acesta să implice fosforilarea anumitor molecule de proteine ​​ale celulei gazdă.

În faza a, celulele de mamifere conțin o cantitate mai mare de polimerază a decât în ​​perioadele nesintetice ale ciclului celular. În plus, în faza β, activitatea enzimelor implicate în formarea de substraturi pentru sinteza ADN (trifosfați deoxi-siribonucleozidici) este îmbunătățită. Activitatea acestor enzime scade la ieșirea din faza β și rămâne la un nivel scăzut până când este primit un semnal pentru a relua sinteza ADN-ului. În faza β, are loc o replicare completă și strict o singură dată a ADN-ului nuclear. Se pare că cromatina replicată este cumva marcată, ca rezultat

Orez. 38.21. Ciclul diviziunii celulare a mamiferelor. Faza de sinteză a ADN-ului (faza β) este separată de mitoză prin perioadele G și G. (Săgeata indică direcția ciclului celulei.)

care interferează cu replicarea ulterioară până când celula suferă mitoză. Se poate presupune că grupările metil acționează ca un astfel de marker covalent (adică, etichetarea ADN se efectuează datorită metilării sale).

De regulă, fiecare pereche dată de cromozomi este reprodusă simultan și într-un interval strict definit al fazei S. Natura semnalelor care reglează sinteza ADN-ului la acest nivel este necunoscută, dar, aparent, fiecare cromozom individual posedă un astfel de mecanism de reglare.

Degradarea și repararea ADN-ului

Transmiterea informațiilor ereditare într-o formă nedistorsionată este cea mai importantă condiție pentru supraviețuirea atât a fiecărui organism specific, cât și a speciei în ansamblu. În consecință, pe parcursul evoluției, ar fi trebuit să se formeze un sistem care să permită celulei să corecteze daunele ADN cauzate de erori de replicare sau de influențe dăunătoare mediului. Se estimează că, ca urmare a deteriorării cauzate de aceste cauze, în genomul celulelor germinale umane apar în medie șase substituții de nucleotide pe an. Aparent, aproximativ același număr de mutații are loc în celulele somatice pe an.

După cum este descris în cap. 37, condiția de bază pentru o replicare exactă este asocierea corectă a nucleotidelor. Acuratețea interacțiunilor complementare depinde dacă nucleotidele purinei și pirimidinei se află într-o formă tautomerică prietenoasă pentru împerechere (Figura 34.7). În echilibru, concentrația formelor tautomerice favorabile de nucleotide depășește concentrația tautomerilor nefavorabili cu 104-105 de ori. În mod clar, acest lucru nu este suficient pentru a asigura o recunoaștere inconfundabilă. De aceea, există un sistem special pentru monitorizarea acurateței perechii de nucleotide în celulele bacteriilor și mamiferelor. Această etapă este verificată de două ori: prima dată - când trifosfații dezoxiribonucleozidici sunt incluși în lanțul de creștere și a doua oară - după pornire, folosind un mecanism volatil pentru îndepărtarea nucleotidelor inserate eronat din catena de ADN nou sintetizată. Datorită acestui control, erorile de pornire apar nu mai des de o dată la 108-10 bp. În celulele E. coli, acest mecanism este asigurat de ADN polimeraza, care are activitate. În același timp, ADN polimerazele de mamifere nu au o activitate de nuclează corectantă pronunțată.

Factorii de mediu fizici și chimici cauzează patru tipuri de deteriorare a ADN-ului (vezi Tabelul 38.2). Zonele deteriorate pot fi reparate, înlocuite prin recombinare sau pot rămâne neschimbate. În ultimul caz, apar mutații, care pot duce la moartea celulelor. Posibilitatea de reparare și înlocuire se bazează pe redundanța informațiilor codificate în structura ADN-ului cu dublă catenă: o regiune defectă a unei catene de ADN poate fi corectată de-a lungul unei catene complementare intacte.

Punctul cheie al tuturor evenimentelor de recombinare și reparații este recunoașterea defectului, însoțită fie de reparații directe, fie de marcare pentru corectarea ulterioară. Termolabilitatea legăturii N-glicozidice a purinelor duce la depurinizarea ADN-ului cu o frecvență de aproximativ 5000-10000 pe celulă (pe zi) la 37 ° C. Locurile de depurinizare sunt recunoscute de enzime speciale,

Tabelul 38.2. Tipuri de deteriorare a ADN-ului

umplând în mod specific golul fără a rupe coloana vertebrală a fosfodiesterului moleculei.

Ambele baze de citozină și adenină sunt dezaminate spontan pentru a forma uracil și, respectiv, hipoxantină. Deoarece ADN-ul nu conține în mod normal nici uracil, nici hipoxantină, nu este surprinzător faptul că β-glicozilazele specifice recunosc aceste baze anormale și le îndepărtează. Pauza rezultată servește ca un semnal pentru acțiunea endonucleazelor specifice purinei sau pirimidinei, care scindează legătura fosfodiester în apropierea locului de leziune corespunzător. După aceea, cu acțiunea secvențială a exonucleazei, repararea ADN polimerazei și ADN ligazei, golul este umplut și structura regulată originală este restaurată (Fig. 38.22). Acest lanț de evenimente se numește reparație excizională. Procesul de reparare a ADN-ului care conține baze alchilate și analogi de baze are loc în mod similar.

Restabilirea ștergerilor și eliminarea inserțiilor are loc utilizând procese de recombinare, care pot continua fie cu participarea la replicare, fie fără aceasta.

Radiațiile ultraviolete induc formarea de dimeri pirimidină-pirimidină.

Orez. 38,22. Enzima uracil-ADN glicozilaza elimină uracilul, care apare în timpul dezaminării spontane a citozinei. (Amabilitatea lui V. Alberts.)

Orez. 38,23. Dimerul timină-timină, format prin legarea bazelor de timină adiacente.

Acest proces afectează în principal situate sub alte baze de timină din același lanț (Fig. 38.23). Există două mecanisme pentru îndepărtarea dimerilor de timină din celulă: reparația excizională și fotoreactivarea. Această metodă de reparare implică fotoactivarea cu lumină vizibilă a unei enzime specifice care inversează procesul care duce la formarea structurii dimerice.

Pauzele ADN monocatenare cauzate de radiațiile ionizante pot fi reparate prin ligaturare directă sau recombinare. Mecanismele implicate în repararea legăturilor încrucișate între bazele catenelor opuse sau între ADN și proteine ​​sunt slab înțelese.

Astfel, repararea daunelor cauzate de radiațiile ionizante și alchilarea de bază se efectuează prin excizie și resinteza secțiunilor ADN scurte. Îndepărtarea daunelor cauzate de iradierea ultravioletă, precum și legarea încrucișată se realizează într-un mod similar, dar în acest caz sunt afectate secțiuni mai extinse ale ADN-ului. În celulele de mamifere, apariția replicării reparatorii este evidențiată prin sinteza ADN neprogramată, adică includerea precursorilor radioactivi în afara fazei S în ADN.

Odată cu intensificarea proceselor de reparare excizională ca răspuns la influențele dăunătoare din celulele de mamifere, crește activitatea enzimei poli (AOP-ribozil) polimerază. Această enzimă, cu participarea unei coenzime, efectuează reacția de ADP-ribozilare a proteinelor cromatinei. Practic, apare mono-ADP-ribozilarea, dar uneori are loc adăugarea de lanțuri homopolimerice (ADP-riboză). Funcția poli (AOP-ribozil) polimerazei sau a produsului său, (ADP-riboză), în procesul de reparație excizională nu este complet clară. Există o corelație în timp între intensificare

procesele de reparare și creșterea activității enzimei. Inhibarea specifică a activității acestei enzime previne eliminarea rupturilor în catena ADN. Creșterea activității poli (ADP-ribozil) polimerazei este aparent cauzată de fragmentarea ADN-ului în nucleu. O astfel de fragmentare poate fi indusă în primul rând de agenți fizici (de exemplu, raze X), în plus, poate apărea inadecvat intens în timpul reparării daunelor ultraviolete sau daunelor cauzate de agenții de alchilare. Creșterea activității enzimatice cauzată de rupturile ADN este atât de mare încât poate duce la epuizarea depozitului intracelular al coenzimei NAD +.

Xeroderma pigmentară este o boală ereditară autosomală recesivă. Sindromul clinic implică sensibilitate la lumina soarelui (lumină ultravioletă), ceea ce duce la formarea de leziuni multiple de cancer de piele și deces. Se pare că această boală este asociată cu încălcări ale proceselor de reparație. În celulele cultivate ale pacienților cu xerodermie pigmentară, intensitatea fotoreactivării dimerilor timinici este redusă. Cu toate acestea, tulburările genetice actuale care duc la xeroderma pigmentară includ cel puțin 7 grupe de complementare, ceea ce indică complexitatea cauzelor acestei boli.

Cu yuseroderma pigmentată, celulele majorității (dacă nu toate) grupurilor de complementare prezintă anomalii în rata și intensitatea răspunsului poli (AOP-ribozil) polimerazei la iradiere ultravioletă. În celulele cu cel puțin un grup de complementare, scăderea activității enzimei este aparent asociată cu incapacitatea de a tăia firul de ADN la locul afectat, deoarece adăugarea deoxiribonucleazei la astfel de celule defecte normalizează nivelul poli (AOP-ribozil) activitatea polimerazei.

Pacienții cu ataxie - telangiectazie (o boală autozomală recesivă care duce la ataxie cerebelară și neoplasm limforeticular) au o sensibilitate crescută la radiațiile cu raze X. La pacienții cu anemie Fanconi (anemie autozomală recesivă, însoțită de o incidență crescută a cancerului și instabilitate cromozomială), este probabil ca sistemul de reparare a legăturii încrucișate să fie afectat. Toate cele trei sindroame descrise se caracterizează printr-o incidență crescută a tumorilor. Este foarte posibil ca în viitorul apropiat să fie identificate alte boli umane cauzate de tulburări ale sistemului de reparare a deteriorării ADN-ului.

LITERATURĂ

Bauer W. R. și colab. ADN supraînfășurat, Sci. A.m. (Iulie), 1980, 243, 118.

Cantor C.R. Coregrafia ADN, Cell, 1981, 25, 293. Igo-Kemenes T., Horz W., Zachau H. G. Cromatină, Annu.

Rev. Biochem.1982, 51, 89.

Jelinek W. R .. Schmid C. W. Secvențe repetitive în ADN eucariot și expresia lor, Annu. Rev. Biochem.1982, 51, 813.

Jongstra J. și colab. Inducerea structurilor de cromatină modificate de elementele potențatoare și promotor ale virusului simian 40, Nature, 1984, 307, 708.

Kornberg A. Replicarea ADN, Freeman, 1980.

Lindahl T. Enzime reparatoare ADN, Annu. Rev. Biochem.1982, 51, 61.

Loeb L. A., Kunkel T. A. Fidelitatea sintezei ADN, Annu. Rev.

Biochem, 1982, 51, 429.

McGhee J. D., Felsenfeld G. Structura nucleozomului, Annu. Rev.

Biochem.1980, 49, 1115.

Nossal N. G. Sisteme de replicare ADN procariotice, Annu. Rev. Biochem.1983, 52, 581.