Metode de reglare a activității metabolice într-o celulă. Metabolism și energie. Organizarea reacțiilor chimice în căile metabolice

Academia Medicală din Moscova numită după I.M. Sechenov

Departamentul de Chimie Generală

Lucrarea abstractă nr. 1

Elevii anul I din 9 grupe

Facultatea departamentului de corespondență VSO

Romashkova Ekaterina Dmitrievna

Moscova 2010

Mecanisme de reglare a proceselor metabolice

Activitatea tuturor căilor metabolice este constant reglată, ceea ce asigură că sinteza și degradarea metaboliților corespund nevoilor fiziologice ale organismului. Această secțiune discută mecanismele unei astfel de reglementări. Problemele de reglare a metabolismului celular sunt prezentate mai detaliat la. Fluxul metaboliților în metabolism este determinat în primul rând de activitate. enzime Pentru a influența o anumită cale, este suficientă reglarea activității enzimei care catalizează etapa cea mai lentă. Aceste enzime, numite enzime cheie se găsesc în majoritatea căilor metabolice. Activitatea enzimei cheie este reglată la trei niveluri independente,

Controlul transcripției. Control pentru biosinteza enzimelor(1) efectuat la data de nivel genetic... În primul rând, vorbim despre sinteza ARNm (ARNm) corespunzător, precum și despre transcrieri gena care codifică enzima, adică O reglarea transcripției.In acest proces sunt implicati proteine ​​reglatoare(RP) (factori de transcripție) care acționează direct asupra ADN-ului. În plus, există regiuni speciale de reglare în gene - promotori- și locurile de legare a proteinelor de reglare (elemente de reglare). Eficacitatea acestor proteine ​​este influențată de metaboliți sau hormoni. Dacă acest mecanism îmbunătățește sinteza enzimei, ei vorbesc despre inducţie, dacă reduce sau suprimă - oh represiune... Procesele de inducție și reprimare se desfășoară numai într-o anumită perioadă de timp.

Interconversie. Interconversia enzimelor cheie acționează mult mai rapid decât controlul transcripției (2). În acest caz, enzima este prezentă în celulă într-o formă inactivă. Când cererea metabolică este declanșată de un semnal din exterior și mediată de un mesager secundar enzima activatoare(E 1) transformă o enzimă cheie într-o formă activă catalitic. Dacă nu este nevoie de această cale metabolică, enzima de inactivare(E 2) face din nou enzima cheie inactivă. Procesul de interconversie constă în majoritatea cazurilor în fosforilarea dependentă de ATP proteine ​​enzimatice protein kinazași, în consecință, defosforilarea fosfatazăÎn cele mai multe cazuri, forma fosforilată a enzimei este mai activă, dar apar și cazuri opuse.

Modularea prin liganzi. Un parametru important care controlează cursul căii metabolice este necesitatea primului reactiv (aici este metabolitul A). Disponibilitatea metabolitului A crește odată cu creșterea activității căii metabolice (3), în care se formează A, și scade odată cu creșterea activității altor căi (4), în care A este consumat. Disponibilitatea lui A poate fi limitată datorită transportului său către alte părți ale celulei.

Adesea factorul limitativ este de asemenea disponibilitatea coenzimei(5). Dacă coenzima este regenerată printr-o a doua cale independentă, această cale poate limita viteza reacției principale. Astfel, de exemplu, glicoliza și ciclul citratului sunt reglate de disponibilitatea NAD+.Deoarece NAD+ este regenerat în lanțul respirator, acesta din urmă reglează catabolismul glucozei și acizilor grași.În sfârșit, activitatea unei enzime cheie poate fi reglementate ligand(substrat, produs final de reacție, coenzimă, alt efector) ca efector alosteric prin legarea acestuia nu în centrul activ în sine, ci într-un alt loc al enzimei și, ca urmare, o modificare a activității enzimatice.Inhibarea unei enzime cheie este adesea cauzată de produșii finali ai reacției lanțului metabolic corespunzător ( inhibitie tip părere ) sau un metabolit implicat într-o altă cale. Primul reactiv al lanțului de reacție poate stimula, de asemenea, activarea enzimei.

Reglarea hormonală a metabolismului

Activarea catalizată de enzime și, în consecință, inactivarea enzimelor cheie ale metabolismului intermediar sunt numite interconversii... Astfel de procese sunt sub control diferit, inclusiv hormonale. Această secțiune discută procesele de interconversie care reglează metabolismul glicogenului în ficat.

A. Reglarea hormonală a defalcării glicogenului

Glicogenul servește ca rezervă de carbohidrați în organism, din care fosfatul de glucoză este creat rapid în ficat și mușchi prin divizare.Rata sintezei glicogenului este determinată de activitatea glicogen sintetazei (în diagrama de mai jos din dreapta), în timp ce clivajul este catalizat glicogen fosforilază(în diagramă, stânga jos). Ambele enzime acționează la suprafața particulelor de glicogen insolubil, unde, în funcție de starea metabolismului, pot fi sub formă activă sau inactivă. Când postești sau în situatii stresante(lupte, alergare) nevoia de glucoză a organismului crește. În astfel de cazuri, hormonii sunt eliberați adrenalinăși glucagon... Ele activează descompunerea și inhibă sinteza glicogenului. Adrenalina funcționează în mușchi și ficat, în timp ce glucagonul funcționează numai în ficat.

Ambii hormoni se leagă de receptori pe membrana plasmatică (1) și activată de proteinele G adenilat ciclază(2) care catalizează sinteza 3”, 5”-ciclo-AMP (cAMP) din ATP (ATP). Opusul este efectul asupra acestui " mesager secundar » fosfodiesteraza cAMP (3), hidrolizarea cAMP la AMP (AMP). În ficat, diesteraza este indusă de insulină, care, prin urmare, nu interferează cu acțiunea celorlalți doi hormoni (neprezentați). cAMP se leagă și astfel activează protein kinaza A(4), care acţionează în două direcţii: pe de o parte, cu ajutorul lui fosforilarea cu participarea ATP ca coenzimă, se transformă în forma D inactivă glicogen sintetazași, ca urmare, oprește sinteza glicogenului (5); pe de altă parte, activează - tot prin fosforilare - o altă protein kinază, fosforilaz kinaza(opt). Fosforilază kinaza activă fosforilează forma b inactivă glicogen fosforilază, transformându-l în a-forma activă (7). Acest lucru duce la eliberarea de glucoză-1-fosfat din glicogen (8), care, după ce a fost transformat în glucoză-6-fosfat cu participarea fosfoglucomutazei, este inclus în glicoliză (9). În ficat, se formează suplimentar glucoza liberă, care intră în fluxul sanguin (10).

Pe măsură ce nivelul cAMP scade, fosfoprotein fosfatază(11), care defosforilează diferite fosfoproteine ​​ale cascadei descrise și, prin urmare, opresc descompunerea glicogenului și inițiază sinteza acestuia. Aceste procese au loc în câteva secunde, astfel încât metabolismul glicogenului se adaptează rapid la condițiile schimbate.

B. Interconversia glicogen fosforilazei

Modificările structurale care însoțesc interconversia glicogen fosforilazei au fost stabilite prin analiza de difracție cu raze X. Enzima este dimer cu simetrie de ordinul doi. Fiecare subunitate are un centru activ, care este situat în interiorul proteinei și în forma b este slab accesibil substratului. Interconversia începe cu fosforilarea reziduului de serină(Ser-14) lângă capătul N-terminal al fiecărei subunități. Reziduurile de arginină ale subunităților învecinate se leagă de grupări fosfat. Legarea inițiază rearanjamente conformaționale care cresc semnificativ afinitatea enzimei pentru activatorul AMP alosteric. Acțiunea AMP și efectul modificărilor conformaționale asupra centrilor activi duc la apariția unei forme a mai active. După îndepărtarea reziduurilor de fosfat, enzima își asumă în mod spontan conformația b originală.

Reglarea hormonală a metabolismului acizilor grași

metabolism enzimă reglare hormonală

Adrenalina si glucagon activează lipaza intracelulară. Acțiunea acestor hormoni este mediată de cascada de reacții a adenil-ciclazei, începând cu activarea adenilat-ciclazei și terminând cu fosforilarea lipazei, care apoi devine activă și scindează legăturile eterice din TAG. Glicerol ca substanță solubilă în plasmă, este transportată la ficat, unde este utilizată în reacțiile de gluconeogeneză. Acid gras transportate de sânge sub formă de complexe cu albumina serică la diferite organe și țesuturi, unde sunt implicate în procesul de oxidare.

Reglarea hormonală metabolismul proteinelor asigură un echilibru dinamic al sintezei și degradarii acestora.

· Anabolism proteic controlat de hormonii adenohipofizei ( somatotropină), pancreas ( insulină), glandele sexuale masculine ( androgen). Întărirea fazei anabolice a metabolismului proteic cu un exces al acestor hormoni se exprimă prin creșterea crescută și creșterea greutății corporale. Lipsa hormonilor anabolizanți provoacă încetinirea creșterii la copii.

· Catabolismul proteinelor reglat de hormonii tiroidieni ( tiroxina si triiodotironona), crustal ( clucocorticoizii) și cerebrale ( adrenalină) substanțe ale glandelor suprarenale. Un exces al acestor hormoni îmbunătățește descompunerea proteinelor în țesuturi, care este însoțită de epuizare și echilibru negativ de azot. Lipsa hormonilor, cum ar fi glanda tiroidă, este însoțită de obezitate.

Astfel, formarea glicogenului în ficat din acid lactic, aparent, oferă o legătură importantă între metabolismul muscular și hepatic. Cu participarea ficatului, glicogenul muscular este transformat în zahăr din sânge disponibil, iar acest zahăr, la rândul său, este transformat în glicogen muscular. În consecință, există un ciclu închis de transformări ale moleculelor de glucoză în organism... S-a demonstrat că adrenalina accelerează aceste reacții în direcția de la glicogenul muscular la glicogenul hepatic... În același timp, insulina accelerează reacțiile în direcția de la glicemia la glicogenul muscular.

C. F. Corey și G. T. Corey, dintr-un articol din Biological Chemistry, 1929

15. PRINCIPII ALE REGLĂRII METABOLISMULUI

Reglarea reacțiilor metabolice este principalul obiectiv al cercetării în biochimie și este una dintre cele mai remarcabile abilități ale celulei vii. Printre miile de reacții enzimatice care au loc în celulă, probabil că nu există una care, într-o formă sau alta, să nu fie supusă reglementării. Deși se obișnuiește în manuale (și este util) să se subdivizeze procesul metabolic în „căi” separate care îndeplinesc anumite funcții în susținerea vieții celulei, o astfel de diviziune nu există în celula însăși. Mai mult, fiecare cale discutată în această carte este indisolubil legată de toate celelalte procese celulare, așa cum arată o rețea multidimensională de reacții (Figura 15-1). De exemplu, în Ch. 14, am discutat trei căi posibile pentru conversia glucozei-6-fosfatului în celulele hepatice: participarea la glicoliză pentru acumularea de ATP, participarea la calea pentozei fosfat pentru a obține NADPH și pentoză fosfați și hidroliza în glucoză și fosfat pentru a completa. depozitele de glucoză din sânge. Dar, de fapt, există o serie de altele modalități posibile transformări glucoză 6-fosfat; poate fi folosit, de exemplu, pentru sinteza altor zaharuri, cum ar fi glucozamina, galactoza, galactozamina, fucoza si acidul neuraminic, poate participa la glicozilarea proteinelor sau poate fi parțial degradat, furnizând acetil-CoA pentru sinteza acizilor grași și steroli. De exemplu, bacteria Escherichia coli folosește glucoza pentru a sintetiza scheletele de carbon ale absolut toate moleculele sale. Când o celulă direcționează glucoza-6-fosfat de-a lungul uneia dintre căi, aceasta afectează toate celelalte căi în care această substanță este un precursor sau intermediar. Orice modificare a distribuției glucozei-6-fosfat într-o cale metabolică afectează direct sau indirect participarea sa la toate celelalte căi.

Modificări similare în distribuția metaboliților apar adesea în viața unei celule. Louis Pasteur a fost primul care a descris o creștere semnificativă a consumului de glucoză (de peste 10 ori) de către o cultură de drojdie în timpul tranziției de la condițiile aerobe la cele anaerobe. Acest fenomen, numit efect Pasteur, nu este însoțit de nicio fluctuație notabilă a concentrației de ATP sau orice altă substanță din sute de intermediari și produse ale metabolismului glucozei. Modificări similare sunt observate în celulele musculare scheletice ale unui alergător de sprint. Celulele au o capacitate extraordinară de a efectua simultan și economic toate aceste transformări metabolice interconectate și de a primi fiecare produs într-o cantitate strict definită și la un moment strict definit în timp în condiții de mediu în schimbare.

Orez. 15-1. Rețea tridimensională de reacții metabolice. O celulă eucariotă tipică este capabilă să sintetizeze aproximativ 30.000 de proteine ​​diferite, catalizand mii de reacții în care se formează sute de metaboliți - mulți implicați în multiple căi metabolice. Ilustrație preluată din baza de date KEGG PATHWAY (Enciclopedia Kyoto a Genelor și Genomelor www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map0ll00.html). Fiecare zonă poate fi examinată mai detaliat, până la nivelul enzimelor și intermediarilor individuale.

În acest capitol, vom ilustra principiile de bază ale reglării metabolice folosind metabolismul glucozei ca exemplu. Vom începe prin a analiza rolul general al reglajului în realizarea homeostaziei metabolice și vom introduce teoria controlului metabolic care poate fi utilizată pentru a conduce analiza cantitativa procese metabolice complexe. În continuare, ne vom opri asupra caracteristicilor reglării enzimelor individuale ale metabolismului glucozei și vom lua în considerare activitatea catalitică a enzimelor implicate în glicoliză și gluconeogeneză, descrisă în cap. 14. Să discutăm și despre proprietățile catalitice și reglatoare ale enzimelor implicate în sinteza și distrugerea glicogenului, unul dintre cele mai studiate exemple de reglare metabolică. După ce am ales să ilustrăm principiile reglării metabolice, metabolismul carbohidraților, am separat-o artificial de metabolismul acizilor grași. De fapt, aceste două procese din celulă sunt foarte strâns legate, așa cum vom vedea în cap. 23.

15.1. Reglarea căilor metabolice

Reacțiile catabolice din metabolismul glicogenului furnizează energia necesară depășirii „forțelor” entropiei, iar reacțiile anabolice duc la formarea moleculelor inițiale pentru biosinteză și stocarea energiei metabolice. Aceste procese sunt atât de importante pentru activitatea vitală a celulelor încât în ​​cursul evoluției au apărut mecanisme de reglare foarte complexe care asigură deplasarea metaboliților pe căile corecte, în direcția corectă și cu viteza necesară pentru a satisface pe deplin curentul. nevoile celulei sau organismului; atunci când condițiile externe se schimbă, rata transformărilor metaboliților în căile metabolice corespunzătoare este ajustată.

Condițiile externe se schimbă, uneori destul de dramatic. Cu un efort fizic mare, nevoia de ATP a mușchilor poate crește de sute de ori în câteva secunde. Disponibilitatea oxigenului poate fi redusă din cauza hipoxiei (deteriorarea livrării de oxigen către țesuturi) sau ischemiei (scăderea fluxului sanguin către țesuturi). Raportul dintre carbohidrați, grăsimi și proteine ​​din alimente variază, iar nutrienții bogati în energie intră neregulat în organism, drept urmare este nevoie de corectarea proceselor metabolice între mese și în timpul postului. Sunt necesare cantități enorme de energie și molecule pentru biosinteză, de exemplu, în vindecarea rănilor.

Celulele și organismele există într-o stare staționară dinamică

Moleculele bogate în energie, cum ar fi glucoza, sunt absorbite de celulă, iar deșeurile metabolice, de exemplu, CO 2, îl părăsesc, dar masa și compoziția celulei, a organului individual sau a animalului adult practic nu se modifică în timp; celulele și organismele există într-o stare staționară dinamică, dar în niciun caz în echilibru cu mediu inconjurator... Substratul pentru fiecare reacție a căii metabolice provine din reacția anterioară la aceeași viteză cu care este transformată în continuare într-un produs. Cu alte cuvinte, deși viteza (v) a fluxului de materie (sau pur și simplu - curgere) în acest stadiu al metabolismului poate fi ridicat și varia foarte mult, concentrația substratului rămâne constantă. Pentru o reacție în doi pași

la v 1 = v 2 concentraţia este constantă. De exemplu, o modificare a ratei cu care glucoza este livrată din diverse surse în sânge este compensată de o modificare a v2 în absorbția glucozei din sânge în țesut, astfel încât concentrația de glucoză din sânge este menținută la aproximativ 5 mM. aceasta homeostaziei la nivel molecular. La oameni, o încălcare a mecanismelor de homeostazie este adesea cauza bolilor. De exemplu, în diabetul zaharat, reglarea concentrației de glucoză din sânge este afectată din cauza lipsei de insulină sau a insensibilității la aceasta, ceea ce implică consecințe dăunătoare asupra sănătății.

Atunci când influențele externe nu se limitează la simple influențe temporare sau când un tip de celulă este transformat într-un alt tip de celulă, reglarea compoziției și metabolismului celular poate fi mai semnificativă și necesită schimbări vizibile și de durată în distribuția energiei și a precursorilor pentru sinteza în pentru a efectua cu acuratețe această tranziție. Imaginați-vă, de exemplu, diferențierea unei celule stem de măduvă osoasă într-un eritrocit. Celula originală conține un nucleu, mitocondrii și puțină sau deloc hemoglobină, în timp ce într-un eritrocit complet diferențiat există o cantitate imensă de hemoglobină, dar nu există nucleu sau mitocondrii. Compoziția acestei celule se schimba constant ca răspuns la semnalele venite din exterior, iar metabolismul s-a schimbat în consecință. Diferențierea celulară necesită reglarea precisă a concentrațiilor de proteine ​​celulare.

În cursul evoluției, a apărut un set remarcabil de mecanisme de reglare care permit menținerea homeostaziei la nivelul moleculelor, celulelor și organismelor întregi. Importanța reglării metabolice pentru organism se reflectă în numărul relativ de gene care codifică elemente ale aparatului de reglare: la om, aproximativ 4000 de gene (aproximativ 12% din toate genele) codifică proteine ​​de reglare, inclusiv diverși receptori, regulatori ai expresiei genice și aproximativ 500 de proteine ​​kinaze diferite! Mecanismele de reglementare funcționează într-un interval de timp diferit (de la secunde la zile) și diferă ca sensibilitate la schimbările din mediul extern. În multe cazuri, aceste mecanisme se suprapun: aceeași enzimă poate fi reglată prin mai multe mecanisme de reglare.

Nu doar cantitatea de enzime este reglată, ci și activitatea lor catalitică

Intensitatea procesului enzimatic poate fi reglată atât prin modificarea cantității de enzime, cât și prin modularea activității catalitice a moleculelor de enzime prezente. Astfel de transformări apar într-un interval de timp de la câteva milisecunde la câteva ore și servesc ca răspuns la un semnal intracelular sau extern. Modificările alosterice foarte rapide ale activității enzimatice sunt de obicei inițiate local prin modificarea concentrației locale a moleculelor substrat mici ale unei anumite căi metabolice (în reacțiile de glicoliză-glucoză), a unui produs de cale (ATP în glicoliză) sau a unui metabolit sau cofactor cheie (cum ar fi ca NADH), care este asociat cu capacitatea metabolică a celulei. Mesagerii secundari (cum ar fi AMR ciclic și Ca 2+), care se formează în interiorul celulelor ca răspuns la semnale extracelulare (hormoni, citokine etc.), mediază și reglarea alosterică, dar cu un efect puțin mai lent asupra mecanismelor de transducție a semnalului (vezi Cap. 12).

Semnalele extracelulare (Fig. 15-2, F) pot fi hormonale (insulina sau adrenalina), neuronale (acetilcolina) sau transmise prin factori de crestere sau citokine. Cantitatea acestei enzime în celulă este determinată de raportul dintre ratele de sinteza și degradarea acesteia. Viteza de sinteză este reglată de activarea (ca răspuns la un semnal extern) a factorului de transcripție (Fig. 15-2, (D; vezi capitolul 28 pentru detalii). Factori de transcripție - acestea sunt proteine ​​nucleare care, după activare, se leagă de regiuni specifice ale ADN-ului (elemente receptive)în apropierea regiunii promotorului genei (punctul de pornire a transcripției) și activează sau suprimă transcrierea acestei gene, ceea ce duce la creșterea sau scăderea producției de proteină corespunzătoare. Activarea factorului de transcripție are loc adesea ca urmare a legării acestuia la un ligand specific și, uneori, este cauzată de fosforilarea sau defosforilarea acestuia. Fiecare genă este controlată de unul sau mai multe elemente receptive care sunt recunoscute de factori de transcripție specifici. Unele gene conțin mai multe elemente receptive și, prin urmare, sunt controlate de mai mulți factori de transcripție diferiți care răspund la mai multe semnale diferite... Grupurile de gene care codifică proteine ​​ale căror acțiuni sunt interconectate, ca în cazul enzimelor de glicoliză sau gluconeogeneză, conțin adesea elemente receptive cu aceeași secvență, astfel încât același semnal, acționând printr-un anumit factor de transcripție, pornește întregul grup de gene. sau oprit simultan. În sect. 15.3 discută reglarea metabolismului carbohidraților prin factori de transcripție specifici.

Rezistența moleculelor de ARNm la ribonucleaze (Fig. 15-2, (D) poate fi diferită, astfel încât cantitatea de ARNm de un anumit tip dintr-o celulă este o funcție a ratelor de sinteza și degradare a acesteia (Capitolul 26). , rata de translație a ARNm pe ribozomi ( fig. 15-2, (4)) este de asemenea reglată și depinde de mai mulți factori, descriși în detaliu în capitolul 27.

Orez. 15-2. Factori care afectează activitatea enzimelor. Activitatea globală a unei enzime se poate modifica din cauza unei modificări a numărului de molecule dintr-o (cantitate) dată de enzimă dintr-o celulă, a activității sale efective într-un anumit compartiment celular ((1) - (6)) sau a modulării. a activității moleculelor de enzime existente, așa cum este descris în detaliu în text. Activitatea unei anumite enzime este determinată de o combinație a acestor factori.

Rețineți că o creștere de n ori a producției de ARNm nu înseamnă întotdeauna o creștere de n ori a sintezei proteinei corespunzătoare.

Molecula de proteină formată există pentru un timp limitat, și anume, de la câteva minute la multe zile (Tabelul 15-1). Viteza de degradare a enzimelor (Fig. 15-2, (5)) este de asemenea diferită și este determinată de condițiile intracelulare. Unele proteine ​​sunt degradate în proteazom (vezi capitolul 28) ca urmare a legării covalente la ubiquitină (rețineți proteina ciclină; vezi fig. 12-46). Rapid cifra de afaceri(sinteză cu degradare ulterioară) este asociată cu costuri energetice ridicate, totuși, proteinele cu un timp de înjumătățire mai scurt (timpul în care rămâne jumătate din cantitatea inițială de substanță) pot ajunge la o nouă stare staționară în ceea ce privește conținutul lor mai repede decât proteine ​​cu un timp de înjumătățire lung, iar câștigul din reacții atât de rapide trebuie să se echilibreze sau să fie mai mare decât cheltuiala energetică a celulei.

Tabelul 15-1. Timpul de înjumătățire estimat al proteinelor în organele mamiferelor

Un alt factor care afectează activitatea eficientă a unei enzime este disponibilitatea substratului acesteia (Figura 15-2, (6)). Hexokinaza musculară nu poate acționa asupra glucozei până când acest zahăr este eliberat din sânge în celulele musculare, iar viteza cu care glucoza pătrunde în celule depinde de moleculele purtătoare (vezi Tabelul 11-3) din membrana plasmatică. În interiorul celulei, unele enzime și sisteme enzimatice sunt conținute în diferite compartimente limitate de membrană; livrarea substraturilor în aceste regiuni poate fi un factor limitator pentru enzimă.

Datorită prezenței acestor câteva mecanisme de reglare a activității enzimatice, celulele sunt capabile să schimbe semnificativ setul de enzime ca răspuns la modificările condițiilor metabolice. La vertebrate, organul cel mai adaptabil este ficatul; de exemplu, înlocuirea alimentelor bogate în carbohidrați cu alimente bogate în lipide afectează transcrierea a sute de gene și, prin urmare, sinteza a sute de proteine. Astfel de modificări globale ale expresiei genelor pot fi cuantificate utilizând micromatrice ADN (vezi Fig. 9-22), care fac posibilă analiza întregului set de ARNm al unui anumit tip de celulă sau organ. (transcriere), sau folosind electroforeza pe gel bidimensională (vezi Fig. 3-21) - o metodă de studiere a tuturor proteinelor unui anumit tip de celulă sau a unui anumit organ (proteomul). Ambele metode sunt foarte utile în studiile de reglare metabolică. Modificările proteomului implică adesea modificări ale întregului ansamblu de metaboliți cu greutate moleculară mică. - metabolom.

După ce, ca urmare a acțiunii mecanismelor de reglare care controlează sinteza și degradarea proteinelor, în celulă s-a format o anumită cantitate din fiecare enzimă, activitatea acestor enzime este în continuare supusă reglementării: prin modificarea concentrației substraturilor; prin expunerea la efectori alosterici; prin modificare covalentă; sau prin legarea proteinelor reglatoare. Toate aceste procese pot modifica activitatea moleculelor individuale de enzime (Fig. 15-2, (7) - (10)).

Toate enzimele sunt sensibile la concentrația substraturilor lor (Fig. 15-2, (7)). Amintiți-vă că în cel mai simplu caz (în condițiile cineticii Michaelis-Menten), viteza de reacție inițială este jumătate din viteza maximă la o concentrație de substrat egală cu Km (adică atunci când enzima este pe jumătate saturată cu substratul). Odată cu scăderea concentrației substratului scade și viteza de reacție, iar la „K m, viteza de reacție depinde liniar de. Acest lucru este important de reținut deoarece concentrația de substrat intracelular este adesea aproape de Km sau sub această valoare. De exemplu, activitatea hexokinazei depinde de concentrația de glucoză, iar concentrația de glucoză intracelulară se modifică odată cu concentrația de glucoză din sânge. După cum vom vedea mai jos, diferite Km corespund diferitelor forme (izoforme) de hexokinază și, prin urmare, prezența diferitelor izoforme ale hexokinazei depinde de concentrația intracelulară de glucoză, care are o anumită semnificație fiziologică.

Exemplul 15-1. Activitatea transportorului de glucoză

Dacă pentru transportorul de glucoză în ficat (GLU T2) Kt (echivalent cu K m) = 40 mM, determinați modificarea ratei de intrare (flux) a glucozei în hepatocite cu o creștere a concentrației de glucoză în sânge de la 3 la 10 mM.

Soluţie. Pentru a determina rata inițială de aport de glucoză, folosim ecuația 11-1 (vol. 1, p. 555).

La 3 mM glucoză

V 0 = V m ax (3 mM) / (40 mM + 3 mM) = V m ax (3 mM / 43 mM) = 0,07 V m ax La 10 mM glucoză

V 0 = V m ax (10 mM) / (40 mM + 10 mM) = V m ax (10 mM / 50 mM) = 0,20 V m ax

Astfel, dacă concentrația de glucoză în sânge a crescut de la 3 la 10 mM, aceasta înseamnă că rata fluxului de glucoză în hepatocite a crescut de aproape 3 ori (0,20 / 0,07).

Activitatea enzimatică poate fi crescută sau scăzută de efectorii alosterici (Fig. 15-2, (8); vezi și Fig. 6-34). Sub influența efectorilor alosterici, cinetica reacției devine de obicei în formă de S în loc de hiperbolic, sau invers (de exemplu, vezi Fig. 15-14, b). În partea cea mai abruptă a curbei în formă de S, mici modificări ale concentrației substratului sau efectorului alosteric pot afecta semnificativ viteza de reacție. După cum am discutat în cap. 5 (p. 239, v. 1), coeficientul de cooperare al lui Hill este folosit pentru a descrie comportamentul enzimelor alosterice, iar o valoare mare a acestui coeficient înseamnă o cooperare mai mare. Pentru o enzimă alosterică cu un coeficient Hill egal cu 4, o creștere de trei ori a concentrației substratului duce la o creștere a vitezei de reacție de la 0,1 Vm ax la 0,9 Vm ax, în timp ce pentru o enzimă care nu are proprietatea de cooperare (Hill coeficientul 1; vezi tabelul 15-2), pentru aceeași modificare a activității enzimatice este necesară o creștere de 81 de ori a concentrației substratului!

Modificările covalente ale unei enzime deja existente sau ale unei alte proteine ​​(Fig. 15-2, (9)) apar în secunde sau minute din momentul sosirii unui semnal, de obicei extracelular. Cea mai frecventă modificare este fosforilarea-defosforilarea (Figura 15-3); până la jumătate din toate proteinele dintr-o celulă eucariotă în anumite condiții sunt fosforilate. Fosforilarea poate modifica proprietățile electrostatice ale situsului activ al enzimei, poate deplasa locul inhibitor al proteinei departe de locul activ, poate afecta interacțiunea acestei proteine ​​cu alte molecule sau poate provoca modificări conformaționale care conduc la modificări ale Vm ax și K m ar putea readuce proteina la starea inițială. Familia fosfoprotein fosfatazelor, dintre care unele sunt ele însele sub control, catalizează defosforilarea proteinelor care au fost fosforilate de protein kinaze.

Tabelul 15-2. Relația dintre coeficientul lui Hill și efectul concentrației substratului asupra vitezei de reacție pentru enzimele alosterice

Orez. 15-3. Fosforilarea-defosforilarea proteinelor. Protein kinazele transferă o grupare fosforil de la ATP la resturile Ser, Thr sau Tyr din proteină. Protein fosfatazele îndepărtează gruparea fosforil ca P i.

În cele din urmă, reglarea multor enzime este realizată prin legarea la proteinele reglatoare (Fig. 15-2, (10)). De exemplu, protein kinaza dependentă de cAMP (PKA; vezi Fig. 12-6) rămâne inactivă până când subunitățile catalitice și reglatoare ale enzimei sunt separate prin legarea cAMP.

Mecanismele considerate de influență asupra ratei unei anumite reacții a căii metabolice nu se exclud reciproc. Destul de des, aceeași enzimă este reglată la nivelul transcripției, precum și prin mecanisme alosterice și legarea covalentă. Combinația acestor mecanisme asigură o reglare rapidă și eficientă ca răspuns la o mare varietate de modificări ale celulei și semnalelor de intrare.

Pentru discuția care urmează, este util să luăm în considerare modificările activității enzimatice în timpul îndeplinirii a două funcții diferite, dar, totuși, complementare. Termenul reglare metabolică vom desemna un proces care vizează menținerea homeostaziei la nivel molecular, adică menținerea anumitor parametri celulari (cum ar fi concentrația metaboliților) chiar și cu o modificare a fluxului de metaboliți într-o cale metabolică dată. Termenul controlul metabolic vom numi procesele care conduc la o modificare a rezultatului căii metabolice în timp ca răspuns la unele semnale externe sau modificări ale condiţiilor. Trebuie spus, însă, că nu este întotdeauna ușor să trasăm o linie clară între aceste două concepte.

De obicei, celula reglează reacțiile care sunt departe de echilibru.

În unele etape ale căii metabolice, reacțiile se apropie de o stare de echilibru (Figura 15-4). Fluxul total de metaboliți în astfel de reacții este determinat de diferența mică dintre ratele reacțiilor directe și inverse, care, atunci când se apropie de starea de echilibru, au valori similare. Micile modificări ale concentrației unui substrat sau a unui produs de reacție pot schimba dramatic viteza totală a procesului și chiar direcția acestuia. Putem identifica aceste reacții aproape de echilibru în celulă dacă comparăm valorile raportului maselor efective Q cu constanta de echilibru a reacției K "eq. Rețineți că pentru reacția A + B -> C + DQ = [C] / [A] [B] Se crede că atunci când Q și K „eq diferă doar cu 1-2 ordine de mărime, reacția este aproape de echilibru. De exemplu, acest lucru se observă pentru șase din 10 reacții de glicoliză (Tabelul 15-3).

Orez. 15-4. Stadiile de echilibru și neechilibru ale metabolismului. Într-o celulă, etapele (2) și (3) ale acestei căi sunt aproape echilibrate; vitezele reacțiilor lor directe depășesc doar puțin vitezele reacțiilor inverse, astfel încât viteza totală (10) este destul de scăzută, iar modificarea energiei libere ∆G ′ pentru fiecare dintre aceste etape este aproape de zero. O creștere a concentrației intracelulare a metaboliților C sau D poate schimba direcția acestor etape. Etapa (1) din celulă este departe de echilibru - viteza reacției înainte este mult mai mare decât viteza reacției inverse. Viteza totală a etapei (1) (10) este mult mai mare decât viteza reacției inverse (0,01) și în stare staționară este egală cu vitezele etapelor (2) și (3). Etapa (1) se caracterizează printr-o valoare negativă mare a ∆G ′.

Cu toate acestea, multe reacții din celulă sunt departe de echilibru. De exemplu, pentru reacția de glicoliză catalizată de fosfofructokinaza-1 (PPK-1), K "eq ≈ 1000 și pentru o celulă tipică în stare staționară Q = [fructoză-1,6-bisfosfat] [AD P] / [fructoză-6-fosfat] [ATP]) ≈ 0,1 (Tabelul 15-3) Datorită faptului că această reacție este atât de departe de echilibru, în condiții intracelulare acest proces este exergonic și se desfășoară în direcția înainte.La concentrații intracelulare tipice de substrat, produs și efector, viteza de conversie a fructozei-6-fosfat în fructoză-1,6-bisfosfat este limitată de activitatea PFK-1, care este reglată de numărul de molecule de PFK-1 și de acțiunea efectorii, fluxul de intermediari ai glicolizei în alte reacții ale acestei căi și viteza de curgere inversă în reacția cu participarea PFK -1 este practic zero.

Tabelul 15-3. Constante de echilibru, rapoarte ale maselor efective și modificări ale energiei libere ale reacțiilor enzimatice în timpul metabolismului carbohidraților

* Pentru simplitate, se presupune că toate reacțiile pentru care ∆G ′<6, близки к равновесию.

Celula nu poate permite reacțiilor cu valori mari ale constantelor de echilibru să se apropie de echilibru. Dacă la concentrațiile celulare obișnuite de fructoză-6-fosfat, ATP și ADP (câțiva milimoli) reacția catalizată de PFK-1 ar putea ajunge la echilibru, atunci concentrația de fructoză-1,6-bifosfat ar fi în intervalul molar, ceea ce ar duce la moartea celulelor din - din cauza presiunii osmotice ridicate.

Să ne uităm la un alt exemplu. Dacă în celulă reacția ATP -> ADP + Pi s-ar putea apropia de echilibru, pentru această reacție modificarea energiei libere ∆G ′ -> 0 (∆Gp; vezi exemplul 13-2, p. 31); ca urmare, ATP-ul și-ar pierde potențialul ridicat ca purtător de grupări fosfat, care este atât de necesar pentru celulă. Prin urmare, este foarte important ca enzimele care catalizează descompunerea ATP și alte reacții exergonice în celulă să fie supuse reglementării, adică, atunci când procesele metabolice se modifică ca urmare a influențelor externe, reacțiile cu participarea acestor enzime sunt ajustate în astfel încât concentrația de ATP să rămână mult mai mare decât nivelul de echilibru. ... Cu astfel de modificări ale metabolismului, activitățile enzimelor sunt ajustate în toate căile metabolice interconectate, ceea ce nu permite stadiilor critice să atingă echilibrul. Prin urmare, nu este surprinzător faptul că multe enzime (cum ar fi PFK -1) care catalizează reacții cu modificări negative mari ale energiei libere sunt fin reglate în multe moduri diferite. Această reglare are loc într-un mod atât de complex încât atunci când se studiază proprietățile unei singure enzime a căii metabolice, este imposibil să se determine cât de mult are această enzimă un efect asupra cursului procesului în ansamblu; pentru aceasta este necesar să se implice teoria controlului metabolic, la care ne întoarcem în Sec. 15.2.

Nucleotidele de adenină joacă un rol deosebit în reglarea metabolismului

Poate că a doua cea mai importantă sarcină a celulei (după protejarea împotriva deteriorarii ADN-ului) este menținerea unui aport constant de ATP. Multe enzime dependente de ATP au Km între 0,1 și 1 mM, iar concentrația normală de ATP în celulă este de 5 mM. Dacă concentrația de ATP ar fi semnificativ mai mică, aceste enzime nu ar putea ajunge la saturație cu substratul lor (ATP), drept urmare rata a sute de reacții care implică ATP ar scădea (Fig. 15-5). Celula probabil nu ar fi fost capabilă să supraviețuiască unui astfel de efect cinetic asupra unui număr atât de mare de reacții.

În plus, o scădere a concentrației de ATP are consecințe termodinamice importante. Deoarece ATP este convertit în ADP sau AMP atunci când lucrează în celulă, raportul / are un efect profund asupra cursului tuturor reacțiilor în care sunt implicați acești cofactori. Același lucru este valabil și pentru alți cofactori - NADH / NAD + și NADPH / NADP +.

Orez. 15-5. Influența concentrației de ATP asupra vitezei inițiale a unei reacții catalizate de o enzimă tipică dependentă de ATP. Pe baza acestor date experimentale pentru ATR K m ≈ 5 mM. În țesuturile animale, concentrația de [ATP] ≈ 5 mM.

De exemplu, luați în considerare o reacție catalizată de hexokinază:

Rețineți că această expresie este adevărată numai dacă substanțele inițiale și produșii de reacție sunt în concentrații de echilibru la care ∆G ′ = 0. Pentru orice alte concentrații ∆G ′ ≠ 0. Amintiți-vă (Cap. 13) că raportul concentrației produselor de reacție la substrat concentrații (raportul maselor care acționează Q determină mărimea și semnul lui ∆G ′ și, prin urmare, forța motrice (∆G ′) a reacției:

De când am schimbat asta forta motrice afectează toate reacțiile cu participarea ATP, în procesul de evoluție, organismele au dezvoltat mecanisme de reglare responsabile de menținerea raportului /.

Concentrația de AMP este mult mai sensibilă la starea energetică a celulei decât concentrația de ATP. De obicei, concentrația de ATP (5-10 mM) în celule este mult mai mare decât concentrația de AMP (<0,1 мМ). При расходовании АТР, например при мышечном сокращении, АМР образуется в результате двустадийного процесса. Сначала при гидролизе АТР образуется ADP , а затем в результате действия adenilat kinaza- AMR:

2ADP AMP + ATR

Cu o scădere cu 10% a concentrației de ATP, creșterea relativă a concentrației de AMP este mai semnificativă decât pentru ADP (Tabelul 15-4). Prin urmare, nu este surprinzător faptul că multe procese de reglementare sunt asociate tocmai cu concentrația AMR. Un rol important ca mediator al reglementării îl joacă protein kinaza dependentă de AMP, care, odată cu creșterea concentrației de AMP, începe să fosforileze proteinele cheie, reglând astfel activitatea acestora. Creșterea [AMR] se poate datora unui aport insuficient de nutrienți sau a unui efort fizic ridicat. Acțiunea protein kinazei dependente de AMP (a nu fi confundată cu protein kinazei dependente de AMPc, vezi Secțiunea 15.5) îmbunătățește transportul glucozei, activează glicoliza și oxidarea acizilor grași, dar în același timp suprimă procesele consumatoare de energie, cum ar fi sinteza de acizi grași, colesterol și proteine ​​( fig. 15-6). În cap. 23 vom discuta mai detaliat această enzimă și mecanismul ei de acțiune în aceste procese.

Tabelul 15-4. Modificări relative ale concentrațiilor de ATP și AMP la consumul de ATP sau grupări funcționale

Orez. 15-6. Rolul protein kinazei dependente de AMP (AMPK) în metabolismul grăsimilor și carbohidraților. În timpul efortului, AMPK este activată ca răspuns la o creștere a concentrației de AMP sau o scădere a concentrației de ATP prin semnale de la sistemul nervos simpatic (SNS) sau hormonii din țesutul adipos (leptina și adiponectina, pentru mai multe detalii vezi capitolul 23). AMPK activat fosforilează proteinele cheie și, prin urmare, reglează metabolismul în multe țesuturi, suprimând procesele consumatoare de energie, cum ar fi sinteza glicogenului, acizilor grași și colesterolului; direcționează metabolismul în afara ficatului pentru a utiliza acizii grași ca molecule de combustibil; iar în ficat, începe gluconeogeneza pentru a furniza creierului glucoză. În hipotalamus, AMPK stimulează comportamentul alimentar, astfel încât organismul să primească mai mulți nutrienți.

Alături de ATP, sute de intermediari metabolici trebuie să fie prezenți în celulă la concentrațiile necesare. De exemplu, intermediarii de glicoliză dihidroxiacetonă fosfat și 3-fosfoglicerat servesc ca precursori pentru triacilgliceroli și, respectiv, serină. Dacă este necesar, viteza de glicoliză trebuie ajustată astfel încât să furnizeze cantitatea necesară din aceste substanțe fără a reduce nivelul de formare a ATP. Același model este valabil și pentru alți cofactori importanți, cum ar fi NADH și NADPH: o modificare a raportului dintre masele lor efective (adică raportul dintre concentrația formei reduse a cofactorului și concentrația formei sale oxidate) are o efect foarte puternic asupra metabolismului.

Desigur, dezvoltarea evolutivă a mecanismelor de reglare a fost influențată și de prioritățile apărute în viața întregului organism. În creierul mamiferelor, rezervele de energie sunt practic absente, astfel încât activitatea creierului este complet dependentă de aportul de glucoză prin fluxul sanguin. Când nivelul glucozei din sânge scade de 2 ori față de normal (4-5 mM), activitatea creierului este afectată, iar o scădere de 5 ori a glucozei din sânge duce la comă și moarte. Hormonii insulină și glucagon, care sunt secretați la niveluri ridicate și, respectiv, scăzute de glucoză, ajută la menținerea nivelului normal de glucoză din sânge; acești hormoni declanșează o serie de reacții metabolice care vizează normalizarea nivelului de glucoză.

În plus, în cursul evoluției, ar fi trebuit să se realizeze un alt efect selectiv, care a condus la selectarea unor mecanisme de reglementare menite să rezolve probleme destul de specifice.

1. Asigurarea eficienței energetice maxime prin prevenirea apariției simultane a reacțiilor căilor metabolice direcționate opus (de exemplu, glicoliză și gluconeogeneză).

2. Distribuția metaboliților între căile metabolice alternative (cum ar fi glicoliza și calea pentozo-fosfatului).

3. Alegerea celei mai potrivite surse de energie pentru rezolvarea sarcinilor curente ale organismului (glucoza, acizi grasi, glicogen sau aminoacizi).

4. Oprirea căilor de biosinteză în timpul acumulării produselor sale.

Capitolele care urmează oferă numeroase exemple ale fiecărui tip de mecanism de reglementare.

Rezumatul Secțiunii 15.1. Reglarea căilor metabolice

■ Într-o celulă staţionară cu metabolism activ, intermediarii metabolici se formează şi se consumă în acelaşi ritm. Dacă, ca urmare a oricăror influențe, se modifică rata de formare sau consum al metabolitului, în celulă are loc o modificare compensatorie a activităților enzimelor, ceea ce duce la restabilirea unei stări de echilibru.

■ Celulele își reglează metabolismul folosind diverse mecanisme în intervalul de timp de la milisecunde la câteva zile, modificând activitatea enzimelor deja existente sau numărul de molecule sintetizate ale unei anumite enzime.

■ Diverse semnale pot activa sau dezactiva factorii de transcripție care reglează expresia genelor în nucleul celulei. Modificările transcriptomului duc la modificări ale proteomului și, în cele din urmă, ale metabolomului celulei sau țesutului.

■ În procesele în mai multe etape, cum ar fi glicoliza, unele reacții la starea de echilibru sunt aproape de echilibru; vitezele acestor reacții sunt controlate de concentrația substratului și scad și cresc odată cu schimbarea acestuia. Alte reacții sunt departe de echilibru; de obicei controlează întregul flux de substanțe într-o anumită cale metabolică.

■ Mecanismele de reglare au ca scop menținerea în celule a unui nivel aproape constant al metaboliților cheie, cum ar fi ATP și NADH, sau glicemia; atunci când nevoile organismului se modifică, se folosesc depozitele de glicogen.

Reacțiile chimice din celule sunt catalizate de enzime. Prin urmare, nu este surprinzător că majoritatea metodelor de reglare a metabolismului se bazează pe două procese conducătoare: modificări ale concentrației enzimelor și activitatea acestora. Aceste metode de reglare a metabolismului sunt caracteristice tuturor celulelor și sunt efectuate folosind o varietate de mecanisme ca răspuns la semnale de diferite tipuri. În plus, celulele posedă modalități suplimentare de reglare a metabolismului, a căror varietate este convenabilă de luat în considerare în conformitate cu mai multe niveluri de organizare.

Reglarea la nivel de transcriere... Acest tip de reglare este discutat în Capitolul 3 cu câteva exemple de control pozitiv și negativ al transcripției genelor procariote. Acest mecanism este caracteristic, în primul rând, pentru reglarea cantității de ARNm care determină structura enzimelor și, în plus, pentru proteine-histone, ribozomale, proteine ​​de transport. Grupul celor din urmă, care nu posedă activitate catalitică, joacă, de asemenea, un rol important în modificarea ratei proceselor corespunzătoare (formarea cromozomilor și a ribozomilor, transportul substanțelor prin membrane) și, prin urmare, metabolismul în ansamblu.

Proteinele reglatoare sunt implicate în reglarea transcripției genelor, a cărei structură este determinată de gene specifice (regulatori), complexele lor cu liganzi(de exemplu, lactoza la inducerea transcripției sau triptofanul la reprimare), complecșii AMPc-CAP, tetrafosfatul de guanozină și, în unele cazuri, proteinele - produse ale expresiei propriilor gene - au un astfel de efect. De o importanță deosebită în aceste procese sunt molecule de semnalizare atât de importante precum cAMP și guanozin tetrafosfat. Putem spune că cAMP semnalează celulei despre foamea de energie, absența glucozei. Ca răspuns, crește frecvența transcripției genelor structurale responsabile de catabolismul altor surse de carbon și energie (activarea operonilor catabolici, reprimarea catabolică, capitolul 3). Guanozin tetrafosfat (guanozin-5'-difosfat-3'-difosfat) este un semnal de foamete de aminoacizi. Această nucleotidă se leagă de ARN polimerază și își schimbă afinitatea pentru promotorii diferitelor gene. Ca urmare, expresia genelor responsabile de biosinteza carbohidraților, lipidelor, nucleotidelor etc. scade, în timp ce expresia altor gene, în special a celor care determină procesele de proteoliză a proteinelor, dimpotrivă, crește.

Procesul de transcripție este mai des reglat prin modificarea frecvenței evenimentelor de inițiere a transcripției, dar, în plus, rata de alungire a transcripției și frecvența încetării premature a acesteia pot fi reglate. Evenimentele de alungire și terminare sunt influențate în primul rând de starea conformațională a ADN-ului sau a mARN-ului însuși (prezența „semnalelor de oprire”, structurile acelor de păr).

Reglarea alosterică a activității enzimatice... Acest tip de reglare este una dintre cele mai rapide și mai flexibile, se realizează cu ajutorul moleculelor efectoare care interacționează cu centrul alosteric al enzimei (capitolul 6). Reglarea alosterică, ca și reglarea cu operon, este supusă enzime cheie anumite căi metabolice. Astfel, viteza întregului proces biosintetic sau catabolic depinde de una, rareori de mai multe reacții catalizate de enzime cheie.

Reglarea este de o importanță deosebită pentru procesele de biosinteză a aminoacizilor proteinogeni. Deoarece există 20 dintre ele și fiecare în proteina celulară totală din diferite organisme este reprezentată într-un anumit raport, este necesară o reglare foarte precisă pentru a coordona sinteza aminoacizilor individuali. Un astfel de control exclude supraproducția de aminoacizi, iar eliberarea lor din celulă este posibilă numai la microorganismele cu reglare afectată.

Un exemplu de reglare a biosintezei aminoacizilor din familia aspartaților în enterobacterii este prezentat în Fig. 19.3. Patru aminoacizi au un precursor comun, acidul aspartic. Conversia sa în fosfat de aspartil în bacteriile E. coli este catalizată de trei forme izoenzimatice de aspartokinază, fiecare dintre acestea fiind reprimată și/sau inhibată de diferiți produși finali ai acestei căi metabolice ramificate. Sinteza homoserin dehidrogenazei este reglată într-un mod similar.

De remarcat este existența unui mecanism părere, care constă în faptul că produșii finali ai proceselor metabolice reglează nivelul de sinteză și/sau activitatea enzimelor care catalizează primele etape de formare a acestor metaboliți.

O varietate de substanțe pot acționa ca efectori alosterici: substraturi și produși finali ai căilor metabolice, uneori metaboliți intermediari; în procesele catabolice, nucleozidici difosfați și nucleozidici trifosfați, precum și purtători de echivalenți reducători; în reacții în cascadă - cAMP și cGMP, care reglează activitatea enzimelor (de exemplu, protein kinaze) implicate în modificarea covalentă a proteinelor; ioni metalici și mulți alți compuși. Exemple de reglare alosterică a enzimelor sunt date în capitolul 6 și în alte secțiuni.

Modificarea covalentă a enzimelor... Acest tip de reglare a activității enzimatice este altfel numit interconversie a enzimelor, deoarece esența acestui proces este transformarea formelor active de enzime în cele inactive și invers. Caracteristicile și exemplele de modificare covalentă sunt descrise în Capitolul 6. Aceste procese sunt sub control diferit, inclusiv hormonal. Un exemplu clasic de interconversii enzimatice este reglarea metabolismului glicogenului în ficat.

Viteza de sinteză a acestei polizaharide de rezervă este sub controlul glicogen sintazei, iar scindarea este catalizată de glicogen fosforilază. Ambele enzime pot fi sub formă activă și inactivă. În timpul postului sau în situații stresante, hormonii sunt eliberați în sânge - adrenalină și glucagon, care se leagă de receptorii de pe membranele plasmatice ale celulelor și activează enzima adenilat ciclază prin proteinele G (catalizează sinteza cAMP). AMPc se leagă de protein kinaza A și o activează, ceea ce duce la fosforilarea glicogen sintetazei și la traducerea acesteia într-o formă inactivă. Glicogenul nu mai este sintetizat. În plus, protein kinaza A, în cursul reacțiilor în cascadă, provoacă fosforilarea glicogen fosforilazei, care, ca urmare, este activată și începe să descompună glicogenul. Un alt hormon, insulina, acționează și asupra proceselor de sinteză și degradare a glicogenului. În acest exemplu, moleculele de semnalizare sunt hormoni, iar mesagerii sunt proteina G și AMPc. Interconversiile enzimelor se realizează în cursul fosforilării-defosforilării.

Reglarea hormonală. Acest tip de reglare metabolică implică participarea hormonilor - substanțe de semnalizare formate în celulele glandelor endocrine, prin urmare, reglarea hormonală este caracteristică doar organismelor superioare. Cele de mai sus descriu efectul hormonilor asupra procesului de schimb de glicogen, în care activitatea enzimelor este reglată la nivelul modificării covalente. În plus, hormonii pot afecta rata de transcripție (reglarea operonilor).

Din celulele specializate, unde hormonii sunt sintetizați, aceștia din urmă intră în fluxul sanguin și sunt transferați către celulele țintă care au receptori capabili să lege hormonii și să perceapă astfel un semnal hormonal. Legarea unui hormon de un receptor declanșează o cascadă de reacții care implică molecule mediatoare care culminează cu un răspuns celular. Hormonii lipofili se leagă de un receptor intracelular (proteină) și reglează transcripția anumitor gene. Hormonii hidrofili acționează asupra celulelor țintă prin legarea de receptorii de pe membrana plasmatică.

Pe lângă hormoni, alte substanțe de semnalizare au un efect similar: mediatori, neurotransmițători, factori de creștere. Nu există o limită clară pentru a distinge hormonii de substanțele enumerate. Mediatorii sunt numiți substanțe semnalizatoare care nu sunt produse de glandele endocrine, ci de diferite tipuri de celule. Mediatorii includ histamina, prostaglandinele, care au un efect asemănător hormonilor.

Neurotransmițătorii sunt considerați substanțe semnalizatoare produse de celulele sistemului nervos central.

Modificări ale concentrației metaboliților ... O condiție importantă care asigură o rată ridicată a uneia sau alteia căi metabolice este concentrația de substraturi. Poate depinde de intensitatea altor procese în care sunt consumate și aceste substraturi (concurență), sau de viteza de transport a acestor substanțe prin membrane (plasmă sau organite). În special, celulele eucariote au capacitatea de a regla metabolismul prin redistribuirea metaboliților în compartimente individuale.

În plus, rata proceselor metabolice este determinată de concentrația de cofactori. De exemplu, glicoliza și CTX sunt reglate de disponibilitatea ADP (capitolele 10, 11) la nivelul modificărilor activității enzimelor alosterice cheie.

Modificarea post-transcripțională și post-translațională a macromoleculelor... Aceste procese sunt descrise și în secțiunile relevante (capitolul 3). Modificarea și/sau procesarea transcriptelor de ARN primar se realizează la viteze diferite, ceea ce determină concentrația moleculelor de ARN matur care pot fi traduse și, prin urmare, intensitatea sintezei proteinelor. La rândul lor, peptidele, înainte de a fi transformate într-o proteină matură, trebuie și ele modificate, iar dacă este vorba despre enzime, atunci vorbim de modificarea covalentă a acestora.

Scopul oricărei producții biotehnologice este de a obține cantitatea maximă posibilă de produs țintă per unitate de volum a instalației la cel mai mic cost posibil. În practică, există două modalități principale de rezolvare a acestor probleme, care constau, pe de o parte, în crearea de noi tulpini de microorganisme cu capacitate de producție crescută, i.e. capacitatea de a sintetiza unul sau altul produs țintă și, pe de altă parte, de a crea condiții optime pentru ca procesul metabolic de interes pentru noi să se desfășoare în celule.

Rezolvarea acestor probleme într-o măsură sau alta este asociată cu modificări ale proceselor de reglare din celulă; prin urmare, în această secțiune, vom lua în considerare câteva mecanisme de reglare a activității biochimice a unei celule bacteriene.

Într-o celulă vie care funcționează în mod normal, multe reacții chimice catalizate de enzime au loc simultan, ducând la formarea unui număr mare de compuși diferiți. Metabolism normal în celulă ( metabolism) se desfășoară după principiile celei mai stricte economii de energie și substanță, care este asigurată de cel mai complex sistem de reglare a metabolismului.

Toate procesele metabolismului celular pot fi împărțite aproximativ în două grupuri.

1. Procese în care descompunerea substanțelor complexe la mai mult

simple cu energie sunt numite catabolic cataboliti.

2. Procesele în care se sintetizează substanțe complexe din cele simple cu consum de energie se numesc anabolicși produse intermediare și finale - anabolic.

Există o relație strânsă între procesele catabolice și anabolice din celulă. Procesele catabolice servesc ca sursă de energie și „material de construcție” pentru procesele anabolice, iar produsele anabolice pot servi ca substrat pentru procesele catabolice (nutrienți) sau pot servi ca catalizatori (proteine-enzime).

Cel mai simplu mod de a regla orice cale metabolică se bazează pe disponibilitatea substratului. Într-adevăr, în conformitate cu legea acțiunii masei, o scădere a cantității de substrat reactiv (concentrația acestuia în mediu) duce la o scădere a vitezei procesului (reacției) prin această cale metabolică. Pe de altă parte, creșterea concentrației substratului duce la stimularea acestei căi metabolice. Prin urmare, indiferent de orice alți factori, prezența (disponibilitatea) substratului este cel mai important mecanism pentru intensificarea oricărui proces metabolic. Uneori, un mijloc eficient de creștere a randamentului produsului țintă este creșterea concentrației în celulă a unui anumit precursor. Cu toate acestea, spre deosebire de procesele chimice, în biotehnologie această cale are propriile limitări, deoarece concentrațiile mari de substraturi (mai mult de 3-5%), cum ar fi glucoza sau zaharoza, de obicei inhibă dramatic creșterea microorganismelor, care este folosită, de exemplu, pentru conservarea fructelor de pădure și a fructelor. Acest lucru se datorează în primul rând efectului osmotic, care este cauzat de o diferență mare în concentrația acestor substanțe în interiorul celulelor și în mediu.

Cu toate acestea, celulele au multe ordine de mărime un mecanism mai eficient pentru controlul proceselor metabolice, bazat pe reglarea aparatului enzimatic al celulei. O astfel de reglementare poate fi efectuată în cel puțin două moduri. Una dintre ele este foarte rapidă (realizat în câteva secunde sau minute) este schimbarea activității catalitice a moleculelor de enzime deja existente. Al doilea, mai lent (realizat în mai multe minute), constă în modificarea ratelor de sinteză (cantității) de enzime. Ambele mecanisme folosesc un singur principiu de control al sistemului - principiul feedback-ului.

Deoarece toate procesele care au loc în celulă necesită participarea unor catalizatori proteici specifici - enzime, atunci numărul total de enzime din celule poate varia de la câteva zeci la câteva sute, iar procentul acestora în raport cu alte proteine ​​celulare va fi destul de mare (până la câteva procente chiar și pentru o enzimă).

Cu toate acestea, energia (ATP) și materiile prime ale celulei (aminoacizi) nu sunt suficiente pentru sinteza simultană a tuturor enzimelor necesare. Prin urmare, sunt sintetizate în mod constant doar acele enzime care susțin funcțiile celulare de bază (de exemplu, enzimele de glicoliză, CTX). Aceste enzime sunt numite constitutiv. Alte enzime adaptativ sau inductibil, sunt sintetizate doar ca răspuns la apariția unor factori sau substanțe externe - inductori, care sunt substraturi (nutrienți) sau analogii acestora.

Nivelul de sinteză a unor astfel de enzime este reglat de două mecanisme - inducție și reprimare.

Inducția este înțeleasă ca o creștere relativă a sintezei unei enzime sau a unui grup de enzime care participă la aceeași secvență de reacții, de exemplu, la descompunerea unei substanțe complexe în altele mai simple. Se numesc enzime a căror sinteză este reglată în acest fel adaptativ sau indus (inductibil), și substraturile care provoacă sinteza lor - inductori... Sub influența inductorilor, numărul de enzime adaptive poate crește de sute de ori. Deci, pentru E. coli s-a stabilit că într-o cultură crescută pe mediu cu glucoză, prezintă doar urme de β-galactozidază, care realizează reacția de scindare a lactozei la α-galactoză și D-glucoză. Când cultura este transferată într-un mediu cu lactoză, în câteva minute, începe sinteza activă a β-galactozidazei și în cultura adaptată până la 3 % din continutul de proteine ​​cade asupra acestei enzime.

Pentru enzimele inductibile, s-a constatat că:

a) enzima apare în toate celulele în același timp și acest lucru nu poate fi explicat prin mutații;

b) enzima indusă este sintetizată în întregime în celulă din aminoacizi sau, după cum se spune, se formează de novo (inițial) .

c) enzima este sintetizată atâta timp cât există un inductor în mediu. Inducția reglează sinteza enzimelor implicate în procesele catabolice, adică. enzimele inductibile sunt necesare pentru absorbția substraturilor de către celulă și includerea lor în metabolism.

În producția industrială de enzime, analogii structurali neutilizabili ai substraturilor sunt adesea inductori excelenți. De exemplu, pentru β-galactozidază, această substanță este izopropil-β-D-tio-galactopiranozidă (IPTG), un analog nemetabolizabil al lactozei. Acest lucru vă permite să creșteți randamentul enzimei, care nu este consumată în reacția enzimatică și să facilitați purificarea acesteia, deoarece IPTG este luat într-o cantitate semnificativ mai mică decât lactoza și nu există produse de degradare în fluidul de cultură.

Al doilea mecanism de reglare a sintezei enzimatice este represiune, când se observă o scădere relativă a sintezei unei enzime sau a unui grup de enzime care participă la aceeași secvență de reacții, reprimarea produsului finalși represiunea katabolită... Reprimarea de către produsul final se observă numai pentru enzimele care desfășoară reacții anabolice. În prezența produsului final al căii anabolice în celulă, rata de sinteză a tuturor enzimelor implicate în formarea acesteia scade. Acest proces vă permite să economisiți proteinele celulare prin oprirea sintezei acelor enzime care nu sunt necesare în prezent de către celulă.

Reprimarea de către cataboliți este caracteristică reacțiilor de descompunere a substanțelor organice complexe de către microorganisme. Acest mecanism permite celulei să folosească un substrat mai accesibil, ceea ce asigură o rată mare de creștere a culturii. Se preferă acele substraturi a căror descompunere implică mai puține etape: microorganismele preferă zaharurile simple celor complexe, aminoacizii peptidelor etc. Unul dintre exemplele de represiune catabolică este „efectul glucozei” – fenomen observat la creșterea microorganismelor pe medii care conțin alte surse de carbon alături de glucoză.în asimilarea unor substraturi mai complexe până când toată glucoza a fost epuizată.

Reglarea metabolismului celulei microbiene poate avea loc și prin modificarea activității enzimatice a enzimelor disponibile. Acest fenomen se observă în principal în procesele anabolice. Mecanismul cel mai studiat este inhibarea activității enzimatice de către produsul final (retroinhibarea), când activitatea enzimei la începutul transformării în mai multe etape a substratului este inhibată de metabolitul final.

Pentru prima dată, prezența unui astfel de mecanism de reglare a fost raportată în 1953 la studierea biosintezei triptofanului de către celulele E. coli. Etapa finală a biosintezei acestui aminoacid aromatic constă din mai multe etape catalizate de enzime individuale. S-a constatat că la unul dintre mutanții E. coli cu biosinteză afectată de triptofan, adăugarea acestui aminoacid (care este produsul final al acestei căi de biosinteză) inhibă dramatic acumularea unuia dintre precursori, indol glicerofosfat, în celule. Chiar și atunci, s-a sugerat că triptofanul inhibă activitatea unei enzime care catalizează formarea de indol glicerofosfat. Ceva mai târziu, s-a stabilit în mod clar că o astfel de enzimă sensibilă la triptofan este antranilat sintetaza, care catalizează o reacție anterioară a căii triptofanului - formarea acidului antranilic din acid corismic și glutamina. Acest fapt a fost dovedit experimental într-un experiment când adăugarea de triptofan la extractele celulare de E. coli conţinând enzima antranilat sintetază şi substraturile acesteia (corismat şi glutamina) a condus la o inhibare accentuată a formării antranilatului. Mai mult, a fost demonstrat fără echivoc că activitatea antranilat sintetazei este inhibată numai de triptofan și niciun alt metabolit celular nu are un efect similar.

Datorită acestui fenomen, microorganismele împiedică supraproducția de produse metabolice intermediare cu greutate moleculară mică, cum ar fi aminoacizii, nucleotidele purine și pirimidinice. De regulă, substratul enzimei inhibate diferă mult de produsul final - inhibitorul, iar această circumstanță ne permite să presupunem că produsul final nu se combină cu centrul activ al enzimei, ci cu un reglator special sau alosterică(din greacă. „allos” – altul, „steros” – spațial), centru. Atașarea produsului final la centrul alosteric al enzimei este însoțită de pierderea activității catalitice normale din cauza modificărilor conformaționale ale structurii moleculei proteice.

În comparație cu inducția și represiunea, retroinhibarea este un instrument pentru reglarea rapidă și precisă a proceselor metabolice.

Retroinhibarea este un fenomen extrem de nedorit în producția industrială a anumitor metaboliți celulari de interes pentru o persoană, deoarece previne acumularea lor în concentrații mari, ceea ce necesită utilizarea unor instalații mai mari și complică procesul de izolare și purificare a acestora. Și acest lucru, la rândul său, crește costul de producție. Există mai multe abordări pentru a elimina sau a reduce semnificativ efectul retroinhibării. Una dintre ele este că produsul țintă (inhibitorul) este îndepărtat. De exemplu, dacă este un endometabolit, atunci sunt create condiții pentru evadarea sa din celulă în fluidul de cultură, de exemplu, prin creșterea permeabilității membranelor celulare. Dacă produsul țintă este un exometabolit (aminoacizi, antibiotice), atunci acesta este îndepărtat din lichidul de cultură, de exemplu, făcându-l insolubil (sediment). A doua abordare este aceea că, în etapa de sinteză a produsului, la lichidul de cultură se adaugă o substanță metabolită intermediară, a cărei sinteză este blocată de produsul final (vezi sinteza triptofanului). Dezavantajul acestei abordări este că un astfel de predecesor nu poate fi întotdeauna obținut ieftin și în cantități mari. În practică, dacă este posibil, sunt utilizate de obicei ambele abordări.

Alte abordări sunt asociate cu utilizarea metodelor de mutageneză-selecție și inginerie genetică. De exemplu, cu o schimbare mutațională în centrul alosteric (centrul de interacțiune cu inhibitorul), sensibilitatea la inhibitor se pierde, iar enzima își păstrează activitatea la concentrații mari ale produsului final, ceea ce face posibilă crearea mai puternică. tulpini productive de microorganisme producătoare. O versiune mai complexă a acestei abordări este implementată în producția microbiologică de lizină (vezi sinteza lizinei).

Trei tipuri de mecanisme sunt implicate în reglarea căilor metabolice. Prima dintre ele, care răspunde cel mai rapid la orice modificare a situației, este asociată cu acțiunea enzimelor alosterice (Fig. 13-15), a căror activitate catalitică se poate modifica sub influența unor substanțe speciale care au un efect stimulant sau efect inhibitor (se numesc efectori sau modulatori; secțiunea 9.18).

De regulă, enzimele alosterice au loc la începutul sau aproape de începutul unei anumite secvențe multienzimatice și catalizează acea etapă a acesteia care limitează viteza întregului proces în ansamblu; de obicei rolul acestei etape este jucat de o reactie aproape ireversibila.

Orez. 13-15. Reglarea căii catabolice prin tipul de feedback, adică datorită inhibării enzimei alosterice de către produsul final al acestui proces. Literele J, K, L etc. denotă produșii intermediari ai acestei căi metabolice, iar literele E1, E2, E3 etc., sunt enzime care catalizează etapele individuale. Prima etapă este catalizată de o enzimă alosterică (AU, care este inhibată de produsul final al unei anumite secvențe de reacții. Inhibarea alosterică este indicată de săgeata roșie întreruptă, care leagă metabolitul inhibitor cu o reacție catalizată de enzimă alosterică.

În procesele catabolice însoțite de sinteza ATP din ADP, acest produs final, ATP, acționează adesea ca un inhibitor alosteric al uneia dintre etapele incipiente ale catabolismului. Un inhibitor alosteric al uneia dintre etapele incipiente ale anabolismului este adesea produsul final al biosintezei, de exemplu, un aminoacid (Secțiunea 9.18). Activitatea unor enzime alosterice este stimulată de modulatori pozitivi specifici. O enzimă alosterică care reglează una dintre secvențele de reacție catabolică poate, de exemplu, să se supună efectului stimulator al modulatorilor pozitivi-ADP sau AMP și efectului inhibitor al modulatorului negativ-ATP. Sunt cunoscute de asemenea cazuri când o enzimă alosterică a unei căi metabolice reacţionează într-un mod specific la produşii intermediari sau finali ai altor căi metabolice. Acest lucru face posibilă coordonarea ratei de acțiune a diferitelor sisteme enzimatice.

Al doilea tip de mecanisme care reglează metabolismul în organismele superioare este reglarea hormonală (Fig. 13-16). Hormonii sunt substanțe chimice speciale („intermediari”) chimice produse de diverse glande endocrine și eliberate direct în sânge; sunt transportate de sânge către alte țesuturi sau organe și aici stimulează sau inhibă anumite tipuri de activitate metabolică. Hormonul adrenalina, de exemplu, este secretat de medula suprarenală și transportat de sânge către ficat, unde stimulează descompunerea glicogenului în glucoză, ceea ce determină creșterea zahărului din sânge. În plus, adrenalina stimulează descompunerea glicogenului în mușchii scheletici; acest proces duce la formarea de lactat și stocarea energiei sub formă de ATP. Epinefrina provoacă aceste efecte prin atașarea la anumite site-uri receptorilor de pe suprafața celulelor musculare sau a celulelor hepatice.

Legarea adrenalinei servește ca semnal; acest semnal este transmis în părțile interioare ale celulei și aici determină modificarea covalentă, sub influența căreia glicogen fosforilaza (prima enzimă din sistem care catalizează conversia glicogenului în glucoză și alți produși; secțiunea 9.22) trece dintr-un formă activă la una mai activă (Fig. 13-16).

Al treilea tip de mecanisme de reglare a metabolismului este asociat cu o modificare a concentrației acestei enzime în celulă. Concentrația oricărei enzime la un moment dat este determinată de raportul dintre ratele de sinteza și dezintegrarea acesteia. Viteza de sinteză a unor enzime în anumite condiții crește brusc; în consecință, crește și concentrația acestei enzime în celulă. Dacă, de exemplu, un animal primește o dietă bogată în carbohidrați, dar săracă în proteine, atunci ficatul are un conținut extrem de scăzut de enzime care catalizează descompunerea aminoacizilor în acetil-CoA în condiții normale. Deoarece aceste enzime nu sunt practic necesare cu o astfel de dietă, ele nu sunt produse în cantități mari. Cu toate acestea, merită să transferați animalul la o dietă bogată în proteine, iar după o zi în ficat, conținutul de enzime va crește semnificativ, care acum sunt necesare pentru a descompune aminoacizii digerați.

Orez. 13-16. Reglarea hormonală a reacției enzimatice. Ca urmare a atașării hormonului adrenalină la receptorii specifici de pe suprafața celulelor hepatice, se formează adenilatul ciclic cu participarea unei enzime legate de membrană (adenilat ciclază). Acesta din urmă funcționează ca un activator alosteric, sau un mediator intracelular, sub acțiunea căruia glicogen fosforilaza trece de la o formă inactivă la una activă, ceea ce presupune o accelerare a conversiei glicogenului hepatic în glucoză din sânge. Această cale metabolică este descrisă în detaliu în cap. 25.

Orez. 13-17. Inducerea enzimatică. O concentrație intracelulară mare de substrat A poate stimula biosinteza enzimelor E1, E2 și E3. Conținutul acestor enzime în celulă crește și acest lucru creează o oportunitate de a accelera acele reacții în urma cărora excesul de substrat A este îndepărtat. Prin urmare, un exces de substrat A servește ca semnal pentru nucleul celulei, forțându-l să „pornească” genele care controlează formarea enzimelor El, E2 și E3. Includerea genelor înseamnă sinteza ARN-ului mesager corespunzător; pătrunde în ribozomi, iar în urma acesteia se sintetizează în ei enzimele E1, E2 și E3.

Celulele hepatice, prin urmare, au capacitatea de a activa sau opri biosinteza unor enzime specifice, în funcție de natura nutrienților care intră în ele. Acest fenomen se numește inducție enzimatică (Fig. 13-17).